化瘀通絡(luò)解毒顆粒對(duì)肝纖維化大鼠肝臟PDGFB、α-SMA表達(dá)的影響

白靜麗

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院, 吉林 長(zhǎng)春 130021)

肝纖維化是肝臟對(duì)各種致病因素引起肝臟損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，其實(shí)質(zhì)在于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常增多和過量沉積。目前認(rèn)為〔1〕，肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活，是肝臟膠原產(chǎn)生和肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。研究表明，HSC的活化與多種因素有關(guān)，其中，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)起了重要的促進(jìn)作用，α-SMA被認(rèn)為是HSC活化的標(biāo)志?；鐾ńj(luò)解毒顆粒是根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論和多年臨床探索研制而成的復(fù)方中藥制劑，前期研究證明化瘀通絡(luò)解毒顆粒對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有顯著的治療作用〔2,3〕?，F(xiàn)在前期研究的基礎(chǔ)上觀察該制劑對(duì)肝纖維化大鼠肝組織PDGF(PDGFB)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常雄性SD大鼠60只，體重200～220 g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2藥品及主要試劑 化瘀通絡(luò)解毒顆粒由丹參、三七、地龍、虎杖、大黃、鱉甲、黃芪、當(dāng)歸等組成。參照國(guó)家藥典(1990年版)中藥制劑顆粒劑制作方法，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室制備；氧化苦參堿為寧夏延池制藥廠產(chǎn)品，(淡黃色結(jié)晶粉末，純度>99%)用蒸餾水溶解為0.3 g/ml的溶液，冷藏備用。CCl4分析純：購(gòu)自天津市化學(xué)試劑廠。石蠟油購(gòu)自汕頭市光華化學(xué)廠(分析純)。兔抗大鼠PDGFB單克隆抗體、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。DAB試劑盒，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3動(dòng)物模型的建立 受試大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、氧化苦參堿組、化瘀通絡(luò)解毒顆粒組各15只。

動(dòng)物正常喂養(yǎng)1 w后，應(yīng)用40%CCl4豆油溶液，皮下注射給藥，首次按0.5 ml/100 g體重，以后按0.3 ml/100 g體重，注射2次/w，連續(xù)8 w〔4〕。

1.4動(dòng)物分組 正常對(duì)照組：從實(shí)驗(yàn)第1天開始，灌胃生理鹽水1.5 ml/100 g體重，1次/d。模型組：造模同時(shí)，每天灌服等量生理鹽水。陽(yáng)性對(duì)照組：造模同時(shí)，開始灌服溶氧化苦參堿液1.5 ml/100 g體重，1次/d；治療組：造模同時(shí)開始每天以1.5 ml/100 g體重灌服化瘀通絡(luò)解毒顆粒溶液，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.5標(biāo)本的采集 各組于8 w末，于肝左葉同一部位取肝組織迅速投入液氮，之后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存，備肝組織勻漿測(cè)組織生化。一部分置入10%中性甲醛中固定，3 d內(nèi)石蠟包埋，備病理檢測(cè)和免疫組化。

1.6免疫組化染色 采用S-P 法檢測(cè)，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，應(yīng)用HPIAS2000 型圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。結(jié)果判定參照文獻(xiàn)〔5〕略修改：陽(yáng)性染色結(jié)果顯示為細(xì)胞質(zhì)的棕黃色顆粒，細(xì)胞核復(fù)染為藍(lán)色。每張切片不同部位隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野分別記錄顯色程度和顯色范圍，顯色程度分弱、中、強(qiáng)，分別用+，，記錄；顯色范圍占高倍視野<1/4時(shí)記錄+，占高倍視野1/4～2/4時(shí)記錄，占高倍視野2/4～3/4時(shí)記錄，占高倍視野﹥3/4時(shí)記錄。然后按以下公式計(jì)算顯色指數(shù)。顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍(+、、、分別按1、2、3、4分計(jì)算)取均數(shù)為每一種蛋白表達(dá)的最終顯色指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1PDGFB在肝組織中的表達(dá) PDGFB陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色。正常對(duì)照組僅在門靜脈血管內(nèi)呈輕微表達(dá)，模型組陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多，著色較深，主要分布于匯管區(qū)、門脈血管壁、炎細(xì)胞和竇周細(xì)胞,變性的肝細(xì)胞也有表達(dá)。各給藥組PDGFB陽(yáng)性表達(dá)減少，主要見于肝竇旁及匯管區(qū)。免疫組化定量分析結(jié)果表明，模型組PDGFB表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.01)，治療組表達(dá)量明顯下降(P<0.01)，表明化瘀通絡(luò)解毒顆粒能明顯減少大鼠肝臟PDGFB的表達(dá)，PDGFB在各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)及相對(duì)含量，見表1。

2.2α-SMA在肝組織中的表達(dá) α-SMA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色。正常對(duì)照組僅在血管壁少量陽(yáng)性表達(dá)，肝血竇內(nèi)未見陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞。模型組肝小葉中央靜脈附近出現(xiàn)少量的棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，主要分布于肝索間的肝血竇內(nèi)，部分陽(yáng)性細(xì)胞突起延長(zhǎng)。與模型組比較，各給藥組上述部位陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著減少，胞質(zhì)陽(yáng)性染色顯著減輕，α-SMA表達(dá)明顯降低(P<0.01)，且治療組優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝組織中PDGF-B、α-SMA蛋白表達(dá)水平變化±s)

3 討 論

PDGF是最強(qiáng)烈的有絲分裂原，對(duì)HSC的活化、分裂、增殖及其合成膠原等均有明顯的促進(jìn)作用。PDGF有3種形式：PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB。PDGF-AB、PDGF-BB都能促進(jìn)HSC增殖，但PDGF-BB作用最強(qiáng)。肝細(xì)胞受損后，發(fā)生變性、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，激活肝臟的枯否細(xì)胞，釋放大量的細(xì)胞因子，再次激活肝貯脂細(xì)胞，使之增生、活化，轉(zhuǎn)化為肌纖維樣細(xì)胞，表達(dá)α-SMA并釋放一些細(xì)胞因子，使細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，降解減少，最終導(dǎo)致肝纖維化形成。

HSC在活化過程中表達(dá)α-SMA，所以α-SMA是HSC是否激活的重要標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明化瘀通絡(luò)解毒顆粒和氧化苦參堿可抑制肝纖維化大鼠肝HSC活化或增殖。化瘀通絡(luò)解毒顆粒組PDGF-B、α-SMA表達(dá)略低于氧化苦參堿組，但不明顯。

綜上，化瘀通絡(luò)解毒顆粒具有減輕纖維化程度，抑制PDGF-B、α-SMA的表達(dá)。其中抑制PDGF-B、α-SMA的表達(dá)，進(jìn)而抑制HSC的活化可能是其抗肝纖維化的作用機(jī)制之一。

4 參考文獻(xiàn)

1李 才.器官纖維化基礎(chǔ)與臨床〔M〕．北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：2-3.

2白靜麗,劉慶彬.化瘀通絡(luò)解毒顆粒對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1、Smad3表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(10):2946-9.

3江海燕, 王春妍,楊世忠.化瘀通絡(luò)解毒顆粒對(duì)肝纖維化大鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007;13(6):59-60.

4孫敬方．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)〔M〕．北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：474-5．

5Gressner AM, Weiskirchen R,Breitkopf K,etal.Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis 〔J〕.Front Biosci,2002;7(3):793.