全反式維甲酸、亞砷酸對白血病NB4細胞CD44變異體表達的影響

楊 潔 李 杰 李 燕 袁 軍 王瑞倉 王素云 王 超 郝洪嶺

(河北省人民醫院血液科，河北 石家莊 050051)

早幼粒細胞白血病(APL)是急性髓細胞白血病的一個亞型，約90%的APL伴有t(15;17)(q22;q21)，形成PML/RARα融合基因。APL是預后最好的急性髓細胞白血病，但病情兇險，誘導緩解過程中死亡率高，由于老年人常合并多種疾病，對化療等治療的耐受性差，故治療上困難較大。全反式維甲酸(ATRA)和亞砷酸(As2O3)治療APL已獲得肯定療效，尤其上述藥物與化療藥物相比不良反應小,適合于臨床上難以耐受強烈化療的老年患者。黏附分子CD44是一種廣泛分布的細胞表面跨膜糖蛋白，可通過選擇性表達不同的外顯子形成多種同源異構體，即CD44s與CD44v。CD44高表達于所有AML亞型原始細胞上，其在急性白血病細胞上的表達與患者的預后呈負相關，CD44v6可以作為AML的不良預后因子〔1〕。本文應用ATRA和As2O3作用于NB4細胞，觀察不同CD44v分子和PML/RARα表達的變化及相互關系，探討CD44v在急性白血病等血液腫瘤的發生、發展、預后中的重要作用。

1 材料與方法

1.1細胞株及培養 人APL細胞株NB4細胞由河北醫科大學第二醫院惠贈。NB4細胞常規培養于含10%的滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱內培養，每1～2 d傳代1次。取對數生長期細胞為實驗對象。

1.2主要試劑 RPMI-1640、胎牛血清均購自美國GIBCO公司。ATRA購自美國Sigma公司，用前2 w以無水乙醇配成濃度為1 μmol/L的儲存液，-20℃避光保存，用時終濃度為1 μmol/L。As2O3購自哈爾濱伊達藥業有限公司，用前以磷酸鹽緩沖液(PBS液)配成濃度為1 mmol/L的儲存液，4 ℃避光保存，用時終濃度為1 umol/L。鼠抗人CD11b-FITC及同型對照購自美國Biolegend公司。AnnexinV-FITC/PI試劑盒購自北京創根勝泰科技有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1實驗分組 ①空白對照組；②ATRA組：1 μmol/L ATRA；③As2O3組： 1 μmol/L As2O3；④ATRA+As2O3組：1 μmol/L ATRA+1 μmol/L As2O3。

1.3.2MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的NB4細胞，接種于96孔細胞培養板中，每孔加入細胞懸液100 μl，按上述實驗分組分別加入100 μl的藥物，培養24、48、72、96 h后分別取出，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續培養4 h，再加入三聯液100 μl(10%SDS-5%異丁醇-0.012 mmol/L HCl)，均勻震蕩30 min左右，37℃過夜，顯微鏡下觀察著色顆粒消失后，以560 nm為測試波長，讀取吸光度A值。根據如下公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=〔對照組A值-實驗組A值〕/對照組A值×100%。

1.3.3流式細胞儀檢測CD11b抗原表達 取對數生長期的NB4細胞，按實驗分組加入上述藥物，分別培養48、72、96 h，收集各組細胞于流式細胞儀專用管中，每管加4～5 ml PBS液洗滌細胞2次，加單克隆抗體(CD11b-FITC)20 μl，4 ℃避光孵育15～30 min后，再用PBS洗滌1次，棄去上清，加入0.5 ml PBS液重懸細胞，上流式細胞儀檢測。

1.3.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 采用AnnexinV-FITC/PI法。收集不同藥物處理24、48、72、96 h的NB4細胞，以PBS緩沖液清洗2次，棄上清，將細胞重懸于200 μl上樣緩沖液中，加入10 μl AnnexinV-FITC和10 μl PI，混勻，室溫，避光反應15 min，上流式細胞儀檢測。

1.3.5逆轉錄熒光實時定量聚合酶鏈反應(RQ-PCR)法檢測細胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10 mRNA表達 收集空白對照組、經ATRA、As2O3及ATRA+As2O3處理48、72、96 h后的NB4細胞，分別提取RNA，反轉錄cDNA，用PCR儀擴增目的基因，進行熒光定量PCR檢測，由ABI 7300 Real-time PCR System完成。擴增完畢后，進入結果分析界面，以GAPDH為內參照基因，與對照組相比(對照組RQ值為1.0)，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統計分析。引物由上海生物工程公司合成，引物序列：PML/RARα上游引物：5＇-AGTGTACGCCTTCTCCATCA-3＇，下游引物：5＇-CAGAACTG CTGCTCTGGGTCTCAAT-3＇，CD44v3上游引物：5＇-TTTCAACCACACC ACGGGC-3＇，下游引物：5＇- CACTTCCGGATTTGAATGGCT-3＇，CD44v6上游引物：5＇-GGCAACTCCTAGTAGTACAACG-3＇，下游引物：5＇- AGCTGTCCCTGTTGTCGAAT-3＇，CD44v10上游引物：5＇- GGTGGAAG AAGAGACCCAAATC-3＇，下游引物：5＇-CCAAGATGATCAGCCATTC TGG -3＇，β-actin上游引物：5＇-TGGCACCCAGCACAATGAA-3＇，下游引物：5＇-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGC A-3＇。

2 結 果

2.1ATRA、As2O3對NB4細胞的增殖抑制作用 藥物作用于NB4細胞24、48、72、96 h后，ATRA組生長抑制率由(1.75±1.47)%升至(14.5±4.84)%；As2O3組由(3.31±1.02)%升至(20.59±3.88)%；ATRA+As2O3組由(2.56±1.43)%升至(32.45±2.07)%；上述各組對NB4細胞均有增殖抑制作用，隨時間延長，生長抑制率明顯增加；同一時間點，24 h各處理組之間無統計學差異(P>0.05)，其余時間點各組之間均有統計學差異(P<0.05)，生長抑制率As2O3+ATRA組大于其他各組。

2.2ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對NB4細胞表面CD11b抗原表達的影響 作用于NB4細胞48 h、72 h、96 h后CD11b抗原表達ATRA組為(32.47±2.95)%、(84.93±1.45)%、(90.9±0.35)%；AS2O3組(10.96±1.33)%、(15.70±0.87)%、(18.90±0.30)%；ATRA+AS2O3組：(18.56±0.65)%、(21.16±0.65)%、(26.53±0.83)%。各個處理組隨時間延長CD11b表達逐漸增多，各時間點之間有顯著性差異(P<0.05)；同一時間點，各處理組間比較，CD11b的表達ATRA組高于 ATRA+As2O3組，高于As2O3組。

2.3As2O3、ATRA+As2O3對NB4細胞凋亡的影響 作用于NB4細胞24、48、72、96 h后，As2O3組早期凋亡率為(9.53±0.59)%、(13.77±0.70)%、(18.27±0.35)%、(16.23±1.15)%；24、48、72 h As2O3組NB4細胞隨時間延長，中晚期凋亡率〔(3.20±0.43)%、(21.63±0.87)%、(49.33±1.09)%〕及總凋亡率〔(12.73±0.44)%、(35.40±0.30)%、(67.60±1.20)%〕均明顯增高，呈時間依賴性。各個時間點As2O3組凋亡率均高于其他各組(P<0.05)。

2.4ATRA、As2O3、ATRA+As2O3對NB4細胞PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10mRNA表達水平的影響 以各組各指標空白對照RQ值為1，作用于NB4細胞48 h、72 h、96 h后，ATRA+As2O3組PML/RARα及CD44v6的RQ值均逐漸降低；各處理組隨時間延長上述各指標的表達均呈遞減趨勢，且各時間點之間有統計學差異(P<0.05)。同一時間點，不同處理組間，除72 h ATRA組和ATRA+As2O3組CD44v10的變化無統計學差異(P>0.05)外，其他各組PML/RARα、CD44v3、CD44v6、CD44v10的mRNA表達經ATRA+As2O3作用后下降最明顯(P<0.05)。經繪制散點圖并應用直線相關分析得出：經ATRA、As2O3、ATRA+As2O3作用前后，隨時間延長，PML/RARα與CD44v6的變化趨勢均呈正相關，相關系數分別為r=0.98(P<0.01)、r=0.951(P<0.01)、r=0.999(P<0.01)；As2O3作用前后，隨時間延長，PML/RARα與CD44v3的變化趨勢呈正相關，(r=0.965，P<0.01)，其他各組之間無直線相關關系。見表1、2。

表1 ATRA,As2O3,ATRA+As2O3作用于 NB4細胞PML/RARα RQ值±s)

表2 ATRA,As2O3,ATRA+As2O3作用于 NB4細胞CD44v6 RQ值±s)

3 討 論

ATRA和As2O3治療APL的療效已得到國內外公認，二者都具有降解PML-RARα蛋白的能力，ATRA作用于RARα部分，而As2O3作用于PML部分，二者聯合具有協同作用。已有報道，運用RQ-PCR觀察到聯用組比單用組對PML-RARα的轉錄抑制作用明顯〔2〕。As2O3對APL細胞發揮劑量依賴的雙重效果，即相對高的濃度(0.5～2.0 μmol/L)誘導細胞凋亡，相對低的濃度(0.1～0.5 μmol/L)誘導部分細胞分化。

CD44黏附分子在造血細胞生成、白血病的病程進展及治療、預后中的作用日益受到重視，特別是CD44v可能參與了腫瘤的轉移浸潤過程。Yokota等〔3〕發現，急性白血病患者血清CD44水平是正常對照組平均水平的4倍，且與疾病狀態相關。化療后血清CD44水平持續高于500 ng/ml的患者易復發。CD44v，特別是CD44v6的高表達與急性淋巴細胞白血病不良臨床預后相關。他們認為血清CD44或可成為急性白血病患者疾病進展的預測指標。Sansonetti等〔4〕的研究表明，激活CD44可以增強AML5的細胞存活，阻止其凋亡，在這一過程中Mcl-1抗凋亡蛋白發揮了重要作用。

本研究結果提示藥聯合對NB4細胞的增殖抑制最顯著，也說明兩藥聯合對APL療效最好。上述結果與Shen等〔2〕報道的應用RQ-PCR證實ATRA與As2O3聯用組比單用組在PML/RARα的轉錄上有明顯的抑制作用的結論相一致。王秦等〔5〕研究ATRA誘導NB4細胞分化過程中黏附分子CD44的變化，發現ATRA作用NB4細胞后，CD44表達減弱，降低了APL細胞的轉移潛能，這與本實驗得到的結論相一致，而本實驗更進一步研究了CD44變異體的變化。Legras等〔6〕研究表明，AML患者的骨髓和外周血中CD44v6表達明顯高于CD44v3和CD44v9，AML患者CD44v6的高表達預示著常規化療后患者的生存期較短，提出CD44v6可作為AML新的預后指標。本實驗結果與上述Legras等的研究結果有相似之處，而本研究是以APL這一特殊類型白血病為研究對象，并發現CD44v6、CD44v3與PML/RARα的變化趨勢有密切的相關性，說明其有可能成為APL療效觀察和預后判斷的又一有用指標。

存在直線相關關系的兩個指標間不一定存在因果關系。就本實驗而言，結果尚不能說明CD44v6、CD44v3與PML/RARα之間存在因果關系，而導致其變化一致的原因及內在機制不詳。劉佳寧等〔7〕用ATRA或六亞甲基二乙酰胺(HMBA)對HL60細胞誘導分化，發現CD44的表達下調，并通過RT-PCR等方法同時檢測cyclin E、p21和p27 mRNA，提出ATRA和HMBA在HL-60細胞誘導分化中起重要作用，并通過下調CD44、及cyclin E和上調p21、p27 mRNA來介導該誘導分化過程。劉佳寧等〔8〕報道了小劑量高三尖杉酯堿(HHT)可能通過下調CD44基因表達，進而提高p21和p27表達，抑制cyclin E活性而對HL-60細胞產生誘導分化作用。常國強等〔9〕報道CD44單克隆抗體A3D8可通過降低磷酸化ERK-1/2的表達來調節Bim,從而誘導HL-60細胞的增殖抑制和早期凋亡。Gadhoum等〔10〕以A3D8單克隆抗體結合CD44，首次證實了封閉NB4細胞CD44可以抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物CDK p27kip1的降解而上調其水平，使p27kip1與cyclinE/Cdk2復合物的結合更加密切，從而抑制其激酶活性，提示CD44對NB4細胞的生長抑制作用必須有p27的參與。宋清曉等〔11〕報道CD44抗體HI44a通過上調GM-CSFRα、TGFβ1及下調OPN mRNA表達水平，減少OPN的分泌，抑制HL-60細胞增殖，誘導細胞分化。

細胞黏附分子是目前腫瘤研究的熱點之一，靶向治療更是今后惡性血液病的治療趨勢，對體質差、化療耐受力低的老年人來說是最適合的治療方法。CD44尤其是CD44v已證實和各種白血病亞型密切相關。ATRA、As2O3對NB4細胞的誘導分化和促凋亡作用與CD44v的關系，有哪些基因參與、所涉及的具體信號轉導通路等尚需深入研究。

4 參考文獻

1Legras S,Ganthert U,Stauder R,etal.A strong expression of CD44-6vcorrelates with shorter survival patients with acute myeloid leukemia〔J〕.Blood,1998；91: 3401-13.

2Shen ZX,Shi ZZ,Fang J,etal.All-trans retinoic acid/As2O3combination yields a high quality remission and survival in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia 〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2004；101(15): 5328-35.

3Yokota A,Ishii G,Sugaya Y,etal.Potential use of serum CD44 as an indicator of tumour progression in acute leukemia〔J〕.Ematolog Oncol,1999;17(4): 161-8.

4Arnaud Sansonetti,Sébastien Bourcier,Laetitia Durand,etal.CD44 activation〔J〕.enhances acute monoblastic leukemia cell survival via Mcl-1 upregulation〔J〕.Leukemia Res，2012;36(3):358.

5王 秦，景 莉，李曉明，等.維甲酸對人早幼粒白血病細胞株CD44、CD54表達的影響〔J〕.瀘州醫學院學報，2009；32(3)：225-7.

6Gunthert U,Stauder R.A strong expression of CD44-6v correlates with shorter survival of patients with acute myeloid leukemia〔J〕.Blood,1998;91(9): 3401-13.

7Jianing Liu,Gaofeng Bi,Pei'e Wen,etal.Down regulation of CD44 contributes to the differentiation of HL-60 cells induced by ATRA or HMBA〔J〕.Cell Mol Immunol,2007;4(1): 59-63.

8劉佳寧，畢高峰，溫培娥，等.HL-60細胞高三尖杉酯堿誘導后CD44表達變化及機制的研究〔J〕.中華腫瘤防治雜志，2008；15：1361-4.

9常國強，王 建，高 偉，等.CD44單克隆抗體A3D8通過抑制ERK1/2上調Bim誘導HL-60細胞早期凋亡〔J〕.中國實驗血液學雜志，2011；19(3):656-60.

10Gadhoum Z,Leibovitch MP,Qi J,etal.CD44:a new means to inhibit acute myeloid leukemia cell proliferation via p27Kip1〔J〕.Blood,2004;103(3):1059-68.

11宋清曉，吳 勇，陳元仲，等.CD44抗體HI44a對急性髓系白血病細胞株HL-60細胞體外增殖、分化作用的研究〔J〕.中國藥理學通報，2011；3：378-82.