甘草苷對一氧化氮誘導的PC12細胞損傷的保護作用

孫國慶 羅正里

(吉林醫(yī)藥學院人文社科部心理學教研室,吉林 吉林 132013)

神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)中一類與年齡相關(guān)的進行性疾病〔1〕。PC12細胞為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的細胞株，作為典型的神經(jīng)細胞，被廣泛用作神經(jīng)細胞模型研究〔2〕。NO在細胞內(nèi)生成氧自由基，過量的自由基引起腦神經(jīng)細胞氧化還原失衡，進而誘發(fā)細胞凋亡。S-亞硝基-N-乙酰基青霉胺(SNAP) 在水溶液中可產(chǎn)生NO，將其加入PC12細胞培養(yǎng)基中，可以引起神經(jīng)細胞氧化損傷〔3〕。甘草苷(LQ)是甘草的主要有效成分之一，為二氫黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性，如抗抑郁、抗病毒、抗腫瘤、增強免疫調(diào)節(jié)等功能〔4，5〕，但LQ對神經(jīng)細胞的保護作用未見相關(guān)報道。本研究旨在探討LQ對NO誘導的PC12細胞損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1試劑 PC12細胞購自中科院上海細胞生物學研究所；購于中國藥品生物制品檢定所；四甲基偶唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自杭州四季青公司；乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)和分組 將PC12細胞種于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48 h換液一次，胰蛋白酶消化傳代。收集處于對數(shù)生長期細胞，種于96孔板，分為4組：空白對照組、模型組、LQ低劑量組(50 μmol/ml)、LQ中劑量組(100 μmol/ml)、LQ高劑量組(200 μmol/ml)。LQ各劑量組加入SNAP前，先加入相應濃度的LQ處理1 h。除空白組外，各組加入終濃度500 μmol/L 的SNAP造模。

1.3MTT法檢測細胞活力 將處于對數(shù)生長期的PC12細胞1×104個接種至96孔板中200 μl/孔，各組SNAP誘導48 h后，加濃度為10 mol/L的MTT 20 μl，37℃孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，酶標儀570 nm處檢測樣品吸光度值。每組設3個復孔，重復3次。

1.4LDH、SOD、MDA活性測定 SNAP誘導PC12細胞48 h后，收集各組細胞培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書測定各組LDH、SOD、MDA活性。

1.5細胞凋亡率測定 SNAP誘導48 h后，PBS洗滌，胰酶消化后PBS再清洗細胞2次，收集細胞，置于200 μl緩沖液中，Annexin V-FITC/PI避光染色5 min，加入流式細胞儀的樣品室進行檢測。每組設3個復孔，計算平均凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1LQ對NO誘導的PC12細胞活力的影響 MTT結(jié)果顯示，與模型組相比，LQ中劑量組和高劑量組的OD值明顯升高(P<0.05)。提示LQ能夠減弱SNAP對細胞損傷的作用。LDH活性結(jié)果顯示，與模型組相比，LQ中劑量組和高劑量組的細胞培養(yǎng)上清中LDH活性明顯降低(P<0.05)，說明甘草苷可以使PC12細胞膜損傷減輕。見表1。

表1 LQ對NO誘導的PC12細胞活力的影響(n=3，±s)

2.2LQ對NO誘導的PC12細胞抗氧化能力的影響 與空白對照組相比，模型組PC12細胞的SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，LQ中劑量組和高劑量組細胞的SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低(P<0.05)，提示LQ可以增強PC12細胞的抗氧化能力。見表2。

2.3LQ對NO誘導的PC12細胞凋亡率的影響 與模型組比較，LQ中劑量組和高劑量組的細胞分布于凋亡象限的比例逐漸遞減，其細胞凋亡百分率依次為(22.90±12.40)%、(14.76±12.31)%，統(tǒng)計學意義顯著(P<0.01)。見圖1。

表2 LQ對NO誘導的PC12細胞NO、MDA含量的影響(n=3，±s)

圖1 甘草苷對NO誘導的PC12細胞凋亡率的影響(n=3，±s)

3 討 論

NO是一種具有細胞間第二信使功能的效應分子，在神經(jīng)、血管等系統(tǒng)中起著廣泛的作用。在神經(jīng)細胞損傷中神經(jīng)元型的一氧化氮合酶(NOS)及免疫型NOS激活產(chǎn)生的NO可以激活凋亡級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡，具有神經(jīng)毒作用〔6〕。

LDH是細胞內(nèi)的一種穩(wěn)定的酶，細胞損傷后細胞膜通透性增加，LDH漏出細胞外，其含量間接反映神經(jīng)細胞損傷程度。本研究結(jié)果提示LQ對NO誘導的PC12細胞損傷具有保護作用。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活力可以體現(xiàn)機體的抗氧化活力。MDA水平可以標示細胞脂質(zhì)過氧化損傷程度。本實驗結(jié)果顯示，LQ可以增加PC12細胞的抗氧化能力，減少自由基氧化損傷。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，LQ對PC12細胞凋亡有抑制作用。

綜上所述，LQ對NO誘導的PC12氧化損傷和細胞凋亡具有明顯保護作用，其機制可能是清除自由基、降低脂質(zhì)過氧化損傷程度、保護神經(jīng)細胞、減輕自由基對其損害。

4 參考文獻

1Barnes DE，Yaffe K.The projected effect of risk factor reduction on Alzheimer's disease prevalence 〔J〕.Lancet Neurol，2011;10(9):819-28.

2Chen XC，Zhu YG，Wang XZ,etal.Protective effect of ginsenoside Rg1 on dopamine-induced apoptosis in PC12 cell〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2001;22(8):673-8.

3陳曉春，朱元貴，陳麗敏,等.一氧化氮誘導PC12 細胞凋亡及人參皂苷Rg1 的保護作用〔J〕.中國藥理學通報，2002;18(5)：516-9.

4李 翠，徐必學，張永萍,等.甘草中甘草苷的含量測定方法研究〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2009;20(3)：564-6.

5劉俊英，張 穎，閆 爽.甘草的藥理作用〔J〕.中國中醫(yī)藥咨訊，2011;3(9)：461-3.

6Clementi E，Brown CC，F(xiàn)eelisch M，etal.Persistent inhibition of cell respiration by nitric oxide:crucial role of Snitrosylation of mitochondrial complex Ⅰand protective action of glutathione〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1998;95(10)：7631-6.