三氧化二砷對Hep-2細胞體外生物學行為的影響及相關機制

舒 暢 吳慶蓮 許承弼

(大慶油田總醫院集團龍南醫院，黑龍江 大慶 163453)

喉癌在我國北方屬于高發癌，嚴重危害人們的身心健康，由于其生長部位特殊，手術很難徹底切除病灶，必須進行綜合治療，方能提高喉癌的生存率。因此尋求治療喉癌的有效藥物具有十分重要的意義。As2O3是中藥砒霜的主要有效成分，新近研究發現As2O3對肝細胞癌、胃癌、宮頸癌等多種腫瘤細胞有廣譜的細胞毒效應〔1〕，尤其在血液腫瘤治療中被首選。本研究應用Hep-2細胞為靶點，觀察不同濃度As2O3制劑對Hep-2細胞增殖周期進程的影響及亞細胞結構改變。

1 材料和方法

1.1細胞及試劑 Hep-2細胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑，RPMI 1640培養基購于美國Sigma公司，As2O3制劑購自哈爾濱醫科大學第一附屬醫院，胎牛血清購于長春生物制品研究所。

1.2方法

1.2.1MTT比色法 取對數生長期的Hep-2細胞，0.25%胰蛋白酶消化，調細胞數為2×105/ml,接種于96孔塑料培養板內100 μl/孔，當細胞生長達到80%匯合時，分組，0 μmol/L組(對照組)、2.5 μmol/L組、5.0 μmol/L組和10 μmol/L組，每個濃度10復孔，置37℃ 5%二氧化碳培養箱內靜止培養24 h，于結束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續培養6 h后，棄去上清，每孔內加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩5 min ,使MTT還原產物完全溶解，應用酶標儀于570 nm處測定各孔吸光度A值，按下列公式計算Hep-2細胞增殖抑制率，每組實驗重復3次，取平均值。Hep-2細胞抑制率=(1-加藥組細胞A值÷對照組細胞A值)×100%。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞周期 細胞培養及分組同1.2.1不同之處是將96孔塑料培養板改為25 ml培養瓶進行，每個濃度3瓶，培養結束后用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，4℃內保存，上機前過40目網，調細胞數1×106/ml，PI染色，流式細胞儀檢測,細胞周期結果以Modiff 2.0軟件分析。

1.2.3透射電子顯微鏡技術 細胞培養及分組同1.2.1，收集不同濃度的As2O3作用后的Hep-2細胞，移入錐型離心管內，離心棄上清，應用2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結 果

2.1MTT結果 不同濃度As2O3對Hep-2細胞增殖均有抑制作用，且呈劑量依賴性，與對照組相比差異有顯著意義(P<0.05)。見表1。

表1 As2O3對Hep-2細胞增殖抑制率(n=10)

2.2流式細胞儀結果 不同濃度的As2O3對Hep-2細胞增殖周期均有影響。G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期相對增多，組間比較差異顯著。見表2。

表2 不同濃度的As2O3對Hep-2細胞增殖周期各時相影響及凋亡率(n=3，%)

2.3透射電子顯微鏡結果 不同濃度的As2O3對Hep-2亞細胞結構均有改變，2.5 μmol/LAs2O3致Hep-2細胞線粒體腫脹及空泡形成；5.0 μmol/L As2O3致Hep-2細胞膜破裂，高胞高度空化形成；10 μmol/L As2O3致Hep-2細胞核染色質趨邊、凝集，可見凋亡小體改變。見圖1。

2.5 μmol/L組

5.0 μmol/L組

10 μmol/L組

3 討 論

As2O3是中藥砒霜的主要有效成分，新近研究發現As2O3對多種腫瘤細胞有廣譜的細胞毒效應〔1〕，其抗腫瘤作用涉及誘導細胞分化與凋亡，細胞周期阻滯、抑制細胞增殖等多重作用〔2〕。MTT試劑可被哺乳動物活細胞線粒體中的脫氫酶吸收，將黃色的MTT試劑還原成藍色不溶解的甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細胞數及細胞活化狀態呈線性關系。因此，被廣泛用于抗腫瘤藥物的篩選和細胞毒性實驗研究，具有一定的客觀性。

流式細胞儀結果顯示，不同濃度的As2O3對Hep-2細胞周期各時相均有影響，細胞周期是由G1、S、G2和M期所組成的一個復雜的過程〔3〕，其進程受各種細胞周期調節因子的嚴格控制，任何一個環節失控即可發生形態學改變，實驗結果顯示As2O3可阻滯G1期向S期轉化進程，G1期細胞增多，S期細胞減少，從而造成 G2/M期細胞相對增多，而G2/M細胞增多是細胞損傷的普遍反應〔4〕，這點從細胞凋亡率上得到了體現。文獻報道As2O3可使多種腫瘤細胞阻滯于G1期，G1期細胞是指細胞從有絲分裂到DNA復制階段，同時G1期細胞糖元合成最為顯著，而且G1期也是化學藥物作用的敏感點。因此抑制細胞周期G1期的RNA及核蛋白體的合成，可間接地使腫瘤細胞RNA合成減少，從而使腫瘤細胞增殖變緩。

此外，我們還應用透射電子顯微鏡觀察不同濃度的As2O3制劑對Hep-2亞細胞結構變化，細胞器高度空化，線粒體腫脹、膜破裂、細胞核染色質趨邊凝集，可見凋亡小體。總之As2O3對Hep-2細胞有較強的增殖抑制作用，是一種比較有前途的抗腫瘤新藥〔5〕，但是，由于As2O3毒副作用較強，用藥時間、劑量限制非常重要。因此，探討As2O3的最佳濃度尚需深入研究。

4 參考文獻

1高國蘭，杜曉梅，陳文學.三氧化二砷對不同頭頸癌細胞株作用的實驗研究〔J〕.江西醫學院學報，2007；47(5)：14-7.

2郝 杰，劉云鵬.三氧化二砷抗腫瘤臨床應用進展〔J〕.國外醫學腫瘤學雜志，2004；31(2)：122-3.

3Martin LG, Demers GW, Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human Papiloma Viras type/6 E7-expressing human cells in associated regulation of cyclin E 〔J〕.Virol, 1998;72(2):975-85.

4Eillnger Ziegelbauer H, Karasuyama H, Yamada E,etal.Ste20-like kinase(SLK), a regulatory kinase for polo-like (PLK) during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss, 2000;5(6):491-8.

5Chou WC,Dang CV.Acute promyelocytic leukemia: recent advances in therapy and molecular basis of response to arsemic therapies〔J〕.Curr Opin Hematol, 2005;12(1):1-6.