阿維A對正常人外周血樹突細胞的影響

劉麗娟 張國強 溫潔新 于 亮 宣曉梅 李英濤 李艷佳

(河北醫科大學第一醫院皮膚科，河北 石家莊 050031)

樹突細胞(DCs)是人體內“專職的”抗原提呈細胞(APC)，對于調控Th1及Th2細胞分化發揮重要的作用〔1，2〕。CD83和CD86是DCs表面表達的協同共刺激分子和特征性標志分子〔3〕。維A酸是由維生素A衍生而來的化合物，可以調控多種細胞的形態，對多種細胞的增殖、凋亡及上皮細胞和其他細胞的生長和分化等都具有廣泛的生物學活性〔4〕；近年來研究發現它還具有明顯的免疫調節作用。阿維A是第二代維A酸類藥物，具有調節表皮細胞分化和增殖的作用〔5，6〕，在皮膚科領域主要用于銀屑病及一些角化性疾病的治療，具有較好的療效〔7，8〕，但其作用機制與DCs的關系尚不清楚。本文擬探討阿維A對正常人外周血DCs的影響，以期尋找阿維A治療自身免疫性皮膚病的實驗基礎及理論依據。

1 材料與方法

1.1標本來源 健康獻血成人20例，男12例，女8例，年齡20～48歲，平均34歲，抽血前至少2個月內均未系統應用過皮質類固醇及免疫抑制劑。抽血前均簽署知情同意書。

1.2主要儀器及試劑 Epics-XL Ⅱ型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司；阿維A，重慶華邦有限公司惠贈；鼠抗人CD83-FITC單克隆抗體(HB15a)、鼠抗人CD86-PE單克隆抗體(HA5.2B7)，美國Beckman Coulter公司；IL-12 ELISA試劑盒，上海西唐生物科技有限公司。重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)及重組人白介素-4(rhIL-4)，PEPROTECH Asia公司。

1.3人外周血DCs的制備 取健康成人外周靜脈血30 ml(肝素抗凝)，使用淋巴細胞分離液常規方法分離制備外周血單個核細胞(PBMC)。生理鹽水洗滌細胞3次。用含15%胎牛血清的RPMI1640培養液調整細胞濃度為5×109個/L，加入到6孔培養板中(3 ml/孔)，放入37℃和5% CO2培養箱中培養3 h后，棄去培養液，用37℃預溫的RPMI1640培養液輕輕洗去未貼壁的細胞，所獲得的貼壁細胞即為擬誘導DCs的單核細胞。向6孔板中每孔貼壁細胞中加入含有15%胎牛血清、50 μg/L rhIL-4和rhGM-CSF細胞因子的RPMI1640培養液3 ml，放入37℃和5% CO2培養箱中培養，隔日半量換液(吸出30%，加入60%)。同時補充相應的細胞因子。每次換液吸出的培養液均用離心機離心保留培養液中懸浮的細胞。培養6 d后收集懸浮的細胞，即誘導的DCs。

1.4阿維A藥物干預 當DCs培養的第7天，向培養液中加入不同濃度的阿維A，使其藥物濃度分別達到1 nmol/L和10 nmol/L，對照組只加培養液，每組設3個復孔。同時補充相應的rhIL-4和rhGM-CSF細胞因子，繼續置于37℃和5%CO2培養箱中培養，加藥后培養12 h后進行流式細胞術(FCM)及酶聯免疫吸附實驗檢測。

1.5FCM檢測DCs表型 將收集的DCs用生理鹽水洗滌2次，調整細胞濃度為1×1010個/L，每例標本取細胞懸液0.6 ml 分別放入4個試管(0.1 ml/管)，分別加入CD83、CD86及相應的同型對照抗體。混勻后，室溫避光放置30 min，生理鹽水洗滌細胞2次，加入1 ml生理鹽水，上流式細胞儀檢測。

1.6酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測DCs分泌IL-12細胞因子含量 將實驗中收集到的細胞培養液，利用常規的ELISA實驗方法檢測IL-12表達量，具體操作步驟按照IL-12 ELISA試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1FCM檢測DCs中CD83、CD86表達水平 體外成功培養出DCs(圖1)。1 nmol/L和10 nmol/L阿維A作用DCs 12 h后，健康成人外周血DCs中CD83表達率分別為(56.65±7.09)%、(63.82±5.81)%，顯著高于陰性對照組〔(43.55±4.32)%〕(P<0.05)；CD86表達率分別為(65.43±1.79)%、(73.73±2.10)%顯著高于陰性對照組〔(52.96±1.10)%〕(P<0.05)。

2.2ELISA檢測DCs分泌IL-12細胞因子含量 1 nmol/L和10 nmol/L阿維A作用DCs 12 h后，健康成人外周血DCs分泌到細胞培養液中的IL-12表達水平分別為(51.377±4.527)、(60.659±4.973) pg/ml，顯著高于對照組〔(39.927±2.809) pg/ml〕(P<0.05)，且10 nmol/L組較1 nmol/L阿維A組顯著提高(P<0.05)。

阿維A作用前

1 nmol/L阿維A

10 nmol/L阿維A

3 討 論

免疫系統能否維持人體正常的免疫功能在機體生理功能衡定方面發揮至關重要的作用。免疫反應的起始首先由APC經過攝取、加工及處理抗原后，將信息傳遞給T、B細胞，從而引發一系列的免疫應答。DCs是體內“專職的”APC，也是激發初次免疫應答的APC，是機體免疫應答的啟動者〔9〕。DCs按成熟狀態的不同可分為未成熟的DCs(imDCs )和成熟的DCs(mDCs)。CD83被認為是mDCs的特征性表面標記分子，有很強的激活淋巴細胞的功能，是刺激機體產生免疫應答必不可少的調節性分子〔3〕。CD86是T細胞活化所必需的信號分子，缺乏CD86或表達量低可導致機體接觸病原微生物或有害因素刺激時不能將這些抗原信息有效地傳遞給T細胞，不能誘導機體對本身有害的物質清除。IL-12是Th1細胞分泌的細胞因子，可以促使Th0向Th1細胞分化，調節Th1細胞介導的免疫應答。有資料表明，只有DCs成熟時才可以大量分泌IL-12〔10〕，因此IL-12的水平又是衡量DCs是否向成熟方向分化的一個指標。阿維A具有調節表皮細胞分化和增殖的作用。目前阿維A作用于DCs的研究鮮有文獻報道。

本實驗發現，不同濃度阿維A 作用DCs 相同時間后，CD83、CD86表達顯著增加，且隨阿維A濃度的增加而增強，即具有阿維A濃度依賴性。由此推測阿維A可促進DCs表面標記的表達并在一定時間上表現出劑量-效應關系。CD83、CD86的表達明顯上調表明阿維A可以促使DCs向成熟方向分化，增加了DCs激活T淋巴細胞的輔助刺激信號功能，增強了DCs的抗原提呈能力，促進T細胞的增殖和活化，刺激機體產生免疫應答。同時，不同濃度阿維A 作用DCs 相同時間后，IL-12分泌量顯著增加，同樣具有阿維A濃度依賴性。由此推測阿維A對DCs分泌IL-12有強烈的促進作用，誘導Th0向Th1細胞分化，調節Th1細胞介導的免疫應答；同時也可影響DCs的分化，促進DCs向成熟方向分化，這與FCM檢測細胞表面標記的結果一致。

綜上，阿維A可影響DCs的成熟度，促進DCs向成熟方向分化，從而提高DCs的抗原提呈能力，促進T細胞的增殖和活化，誘導機體產生強烈的免疫應答而非誘導機體產生免疫耐受來調節機體的免疫系統。其機制可能與阿維A上調細胞表面標記CD83、CD86的表達和促進細胞因子IL-12的分泌有關，這為臨床治療自身免疫性皮膚病提供了新的理論依據。

4 參考文獻

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9Wu L，Liu YJ.Development of dendritic cell lineages〔J〕.Immunity，2007；26(6)：741-50.

10Liu YJ，Blom B.Th2-inducing DC2 for immunotherapy 〔J〕.Blood，2000；95(8)：2482-3.