occludin、ZO-1在不同來源血管內皮細胞的表達差異

唐堅清 陳 圣 陳林鶯 張 聲

(福建醫科大學附屬第一醫院病理科，福建 福州 350005)

緊密連接(tight junction，TJ) 是由一系列跨膜蛋白和外周蛋白相互作用而形成的一個復雜的蛋白質體系〔1〕。它們共同構成環繞細胞的線狀結構，這些物質共同起作用，維持緊密連接的結構和功能。TJs中最重要的是跨膜蛋白occludin與胞質附著蛋白ZO家族及細胞內與其相連的細胞骨架蛋白。其中occludin是第一個被發現的緊密連接的組成膜蛋白，許多學者曾認為，它是構成緊密連接的主要成分〔2〕，是TJ中最重要的結構蛋白，不僅能通過外環以拉鏈式結合進而產生嚴密的細胞旁封閉，還能與不同的分子結合，參與TJ形成的信號調節〔3〕。研究表明，occludin蛋白表達于各種細胞與組織中，如涎腺腺泡上皮與導管上皮、角膜上皮細胞、泌尿系統上皮細胞、肝細胞等，occludin在動、靜脈系統的血管內皮細胞中也均有表達，并且動脈性血管內皮細胞中其表達量要高于靜脈性血管內皮細胞〔4〕，而血液屏障功能很大程度上與血管內皮細胞的occludin表達量相關，如在血-腦屏障及血-視網膜屏障的血管內皮細胞中其表達量要明顯高于其他的血管內皮細胞，這對于調節血液屏障的通透性起了至關重要的作用〔5，6〕。ZO-1與其同源異構體ZO-2，ZO-3一起，為緊密連接的許多跨膜蛋白和細胞質緊密連接蛋白搭建具有連接作用的腳手架樣平臺，維持和調節上皮屏障功能；同時還參與調節細胞物質轉運、維持上皮極性、細胞增殖分化、腫瘤細胞轉移等重要過程；它同樣表達于各種組織和細胞中，如血管內皮、泌尿系統上皮細胞、肝細胞、消化道上皮等〔7〕。occludin、ZO-1在內皮細胞的表達和分布與內皮細胞的通透性密切相關。occludin、ZO-1在各種不同的惡性腫瘤中的表達分析為國內外研究的熱點，但二者在不同來源的血管內皮細胞中的表達水平是否存在差異，國內外均未見相關報道。為進一步了解occludin、ZO-1在不同來源的血管內皮細胞中的表達情況差異，以及該差異是否具有臨床意義，本實驗利用組織芯片技術及免疫組織化學技術檢測occludin、ZO-1在低-未分化胃癌、高-中分化胃癌、幼年性毛細血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍靜脈5種標本中血管內皮細胞中的分布與表達。

1 材料與方法

1.1實驗材料 低-未分化胃癌、高-中分化胃癌、幼年性毛細血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍靜脈標本均取自福建醫科大學附屬第一醫院2009～2010年手術切除標本的存檔蠟塊各20例，所有患者術前均未經放療和化療。免抗人occludin多克隆抗體、免抗人ZO-1多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化染色超敏試劑盒購自美國Labvision公司；DAB顯色試劑盒購自美國DAKO公司。

1.2實驗方法

1.2.1組織芯片的制備 本實驗采用5×4點陣芯片，將每組標本各20例置于一塊芯片上，每種芯片各制備3塊，共制備組織芯片蠟塊15塊，每個芯片蠟塊均設置內標記。

1.2.2免疫組化染色方法及結果判定 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組織化學染色方法進行occludin、ZO-1免疫組化3步法染色。操作嚴格按照說明書進行，用已知陽性對照片作陽性對照，陰性對照以0.01 mol/L PBS代替一抗，其余步驟不變。

顯微鏡下觀察，occludin免疫組化染色陽性定位于內皮細胞膜和細胞質，呈棕黃色顆粒狀或點狀，根據染色深淺程度及染色細胞占計數細胞百分率，將染色結果分為(-)、(+)、()、()4個等級，并將其中<()者定為低表達，≥()者定為高表達。ZO-1免疫組化染色陽性定位于相鄰內皮細胞之間的細胞膜或細胞質，根據染色部位，將染色結果分為3個等級，并給予評分；染色僅定位于細胞質的定義為(+)，評分1分；染色準確定位于細胞膜的定義為()，評分3分；既有胞漿染色又有胞膜染色的定義為()，評分2分〔8〕；同時根據ZO-1染色的深淺程度分為(+)～()(1～3分)，結合染色定位與染色深淺程度，根據二者乘積將染色結果分為(+)～()，結果≥()者定義為高表達，<()者定為低表達

1.3統計學方法 采用SPSS13.0 for Windows統計軟件進行統計學處理，分析數據采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1occludin在五組標本中血管內皮細胞的表達 實驗結果顯示，occludin陽性定位于血管內皮細胞的細胞膜與細胞質，在五組實驗標本中著色深淺不一，呈點狀或散在分布，且染色細胞占計數細胞的百分比有所不同。見圖1。

A：在高-中分化胃癌組，occludin在腫瘤血管內皮細胞呈較高表達，陽性染色定位于腫瘤細胞的胞膜與胞質；B：在低-未分化胃癌組，occludin在腫瘤血管內皮細胞呈低表達，染色強度低；C：在幼年性毛細血管瘤組，occludin呈高表達，染色強度高，染色細胞數多

根據陽性結果判定標準，發現五組不同標本中，血管內皮細胞occludin的高表達率分別為10%、40%、75%、75%及95%。其中低-未分化胃癌組occludin高表達率最低，臍帶組occludin高表達率最高，根據統計分析結果，可以認為五組標本血管內皮細胞的occludin表達不全相同(P<0.001)。見表1。

通過對低-未分化胃癌組及高-中分化胃癌組標本血管內皮細胞ccludin表達情況進行比較，發現兩組表達差異具有統計學意義(P<0.05),并且胃癌組標本與其余非癌組標本血管內皮細胞occludin表達差異具有統計學意義(P<0.001)(表2)，而幼年性毛細血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍帶組標本之間occludin表達差異不具有統計學意義(P>0.05)。

表1 Occludin在五組標本血管內皮細胞中的表達比較〔n(%)，n=20〕

表2 occludin在胃癌組及非癌組標本血管內皮細胞中的表達情況比較〔n(%)〕

2.2ZO-1在五組標本中血管內皮細胞的表達 實驗結果顯示，ZO-1陽性定位于血管內皮細胞的細胞膜或細胞質，在五組實驗標本中定位不同且著色深淺不一，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色；在幼年性毛細血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜及臍帶標本中，ZO-1定位于血管內皮細胞的胞膜，未見明顯的迷離表達；在低-未分化胃癌及高-中分化胃癌標本中，ZO-1表達于內皮細胞的細胞膜和胞漿，呈現一定程度的迷離表達。見圖2。

A：在高-中分化胃癌組，ZO-1在腫瘤血管內皮細胞呈較高表達，陽性染色定位于內皮細胞的胞膜與胞漿，呈現迷離表達；B：在低-未分化胃癌組，ZO-1在腫瘤血管內皮細胞呈低表達，染色強度低，且迷離表達于胞漿中；C：在幼年性毛細血管瘤組，ZO-1呈高表達，染色強度高，且定位于細胞膜，未見迷離表達

根據陽性結果判定標準，發現五組不同標本中，血管內皮細胞ZO-1的高表達率分別為25%、60%、95%、65%及85%。其中低-未分化胃癌組ZO-1高表達率最低，幼年性毛細血管瘤組ZO-1高表達率最高，根據統計分析結果，可以認為5組標本血管內皮細胞的ZO-1表達率差別具有統計學意義(P<0.001)。見表3。

通過對低-未分化胃癌組及高-中分化胃癌組標本血管內皮細胞ZO-1表達情況進行比較，發現兩組表達差異具有統計學意義(P<0.05),并且胃癌組標本與其余非癌組標本血管內皮細胞ZO-1表達差異具有統計學意義(P<0.05)(表4)，而幼年性毛細血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍帶組標本之間occludin表達差異不具有統計學意義(P>0.05)。

表3 ZO-1在5組標本血管內皮細胞中的表達比較〔n(%)，n=20〕

表4 ZO-1在胃癌組及非癌組標本血管內皮細胞中的表達情況比較〔n(%)〕

3 討 論

腫瘤性血管生成是腫瘤發生、發展、侵襲、轉移的重要前提條件，緊密連接和黏附連接與細胞的增殖和腫瘤的侵襲轉移密切相關，也是近年腫瘤研究的熱點問題，而關于緊密連接在血管內皮細胞上的表達情況國內外研究甚少。

緊密連接的結構與功能異常是人類上皮性腫瘤的共同特點，國內外學者研究發現occludin與ZO-1的表達水平在多種惡性上皮性腫瘤中均與腫瘤分化程度及浸潤深度、淋巴結轉移相關。Tobioka等〔9〕發現在高級別子宮內膜癌中occludin的表達量顯著低于在正常子宮內膜和子宮內膜增生中的表達水平，并且隨著腫瘤惡性程度的增加，occludin的表達也逐漸減少，并且occludin的表達降低與腫瘤的肌層浸潤和淋巴結的轉移相關；本科室陳虹等〔10〕研究發現occludin在胃癌中的表達量低于癌旁正常組織， occludin與胃腺癌發生發展密切相關，并隨著胃腺癌的侵襲進展occludin的表達水平顯著下降；另外Martin 等〔11〕發現ZO-1在乳腺癌及周圍正常組織的表達模式不同，在癌組織中ZO-1呈迷離表達，并且ZO-1的表達降低提示病人的預后差；本科室鄭珂等〔12〕亦發現Z0-1的表達與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移等具有相關性，分化程度低、浸潤深度深、伴有淋巴結轉移及進展期胃腺癌的黏膜層胃腺癌細胞ZO-1迷離表達程度較高。

緊密連接和黏附連接作為上皮細胞和血管內皮細胞之間最頂端的結構，主要是維持表皮和內皮細胞的選擇滲透性屏障功能，與細胞的增殖和腫瘤的形成密切相關。跨膜蛋白occludin及胞漿蛋白ZO-1是緊密連接的主要組成成分，二者的高濃度表達是血管內皮細胞的結構特征及功能基礎，對保持緊密連接的完整性起到關鍵作用，二者表達的減少或缺失導致血管的通透性增加，可能在癌細胞入侵和轉移過程中起至關重要的作用〔13，14〕。

本研究顯示在低-未分化胃癌、高-中分化胃癌、幼年性毛細血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜、臍靜脈等五組標本中，occludin及ZO-1在血管內皮細胞的表達存在差異，并且胃癌標本中血管內皮細胞上occludin及ZO-1高表達率低于非癌組織，低-未分化胃癌組中血管內皮細胞上occludin及ZO-1高表達率低于高-中分化胃癌，而二者在良性血管源性腫瘤(幼年性毛細血管瘤)與反應性血管增生(淺表性胃炎胃黏膜及臍靜脈)三種組織中均為高表達，且表達無顯著差異。筆者同時發現，在幼年性毛細血管瘤、淺表性胃炎胃黏膜及臍帶標本中，ZO-1定位于血管內皮細胞的胞膜，未見明顯的迷離表達，在低-未分化胃癌及高-中分化胃癌標本中，ZO-1表達于內皮細胞的細胞膜和胞漿，呈現一定程度的迷離表達。也就是說，occludin及ZO-1蛋白在血管內皮細胞的表達量及表達模式與血管所在的腫瘤組織的分化程度成正相關，腫瘤組織分化越差，血管內皮細胞上的occludin及ZO-1蛋白表達量就越低，這與國內外研究所報道的occludin及ZO-1蛋白在不同分化的胃腸道腫瘤組織中的分布規律一致〔15〕，二者是否存在一定的分子聯系？

Feng等〔16〕實驗證實白血病細胞誘導產生的MMP-2和MMP-9導致血管內皮細胞上occludin及ZO-1降解，導致血管通透性增加，血腦屏障功能障礙，因此白血病細胞能通過破壞的血腦屏障侵入中樞神經系統。腫瘤組織產生釋放多種細胞因子如TNF-α能直接影響緊密連接蛋白的結構與分布，IL-1β通過抑制occludin轉錄啟動子活性進而導致occludin蛋白表達下調〔17〕，Yang等〔18〕研究表明胃癌組織中VEGF-1與MMP-9表達量顯著增高，二者共同促進腫瘤血管的生成與侵襲轉移。而且MMP-9 mRNA的過表達是胃癌患者的不良預后因素〔19〕。筆者推測腫瘤組織產生的各種因子通過多種途徑導致腫瘤性血管內皮細胞上的occludin及ZO-1表達下調，進而導致血管內皮細胞間隙完整性的破壞，細胞旁間隙增大，血管通透性增高；而與此同時，腫瘤細胞本身在這些因子的作用下occludin及ZO-1的表達也下調，從而導致腫瘤細胞的上皮間質轉換(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)，腫瘤細胞的上皮細胞表型喪失，間質表型獲得，細胞黏附性下降，活動力增強〔20〕。也就是說，在腫瘤組織與腫瘤性血管內皮細胞上的緊密連接功能的共同降低或缺失，這可能會進一步促進腫瘤細胞獲得更強的活動力和遷移能力，離開原發部位，并導致通過血管途徑的侵襲與轉移，使腫瘤細胞的侵襲能力增強，易于發生遠處浸潤與轉移。

總之，深入研究不同來源的血管內皮細胞間緊密連接蛋白occludin與ZO-1的異常表達及其機制，并研究相應有效的干預方法，將有助于對腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移機制的進一步深入了解，為腫瘤靶向治療提供新的思路。

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