依達拉奉對局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮層細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

楊東娜 白 洋 王 策

(沈陽市第五人民醫院，遼寧 沈陽 110023)

腦血管病具有發病率高、致殘率高的特點，其中缺血性腦血管病約占腦血管病的80%。腦缺血再灌注后神經細胞發生壞死和凋亡，壞死區的神經細胞由于完全性缺血發生不可逆的死亡，而缺血半暗帶區仍有可存活的神經元，通過細胞凋亡形式損傷，這部分神經元的損傷是可逆性的，通過影響細胞凋亡而保護這部分神經元是治療缺血性腦血管病的關鍵。

1 材料與方法

1.1實驗動物 Wistar雄性大鼠135只，體重240～280 g，3～4月齡，由長春市高新開發區動物中心提供。合格號為(吉)2010-2011。

1.2藥物和試劑 10%水合氯醛(吉林大學第一醫院藥劑科生產)，氯化紅四氮唑(TTC，國藥集團試劑有限公司生產)，Caspase-3 mRNA原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，抗體用兔抗大鼠Caspase-3抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，4%多聚甲醛(北京化學試劑公司生產的粉末自己配制)TUNEL凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色液(吉林大學基礎醫學部病理實驗室提供)，圖像分析儀(HMIAS-2000醫學圖文分析系統)，生物顯微鏡(OLYMPUS CX31)。依達拉奉注射液：昆明積大制藥有限公司。

1.3動物模型制備 采用改良的Zea Longa線栓法制備大腦中動脈閉塞(MCAO)模型。大鼠術前禁食12 h,不禁水，10%水合氯醛按照0.35 ml/100 g體重給予大鼠腹腔注射麻醉后取仰臥位固定，常規備皮消毒，待大鼠的全身肌肉松弛后開始手術，采用直徑為0.234 mm的斷端打磨光滑的尼龍魚線。手術全程盡量保證無菌操作，術后用慶大霉素注射液沖洗手術創口后逐層縫合，栓線尾端外露部分標記，術后大鼠放置在烤燈下保溫，保證術后肛溫36.5～37.5℃，增加大鼠的術后存活率。術后的大鼠進行Longa等〔1〕神經缺損功能評分:0分：無神經系統損傷體征；1分：不能完全伸展右側前爪；2分：行走時向右側轉圈；3分：站立不穩，向右側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失。功能評分1～3分為模型成功，如實驗有死亡的鼠，取同批次的鼠補足。在缺血后2 h小心外拉栓線約1 cm使其斷端回至CCA內，形成再灌注。假手術組將尼龍線僅留在頸內動脈而不入顱，2 h后，將尼龍線拉回至頸外動脈處。依達拉奉組在再灌注后1、1.5 h在腹腔內注射依達拉奉注射液(按照3 mg/kg)2次。每組各45只。分別于再灌注后6、12、48 h處死大鼠。術后假手術組和模型組大鼠各分成3組，分別檢測腦梗死體積、缺血區神經細胞凋亡情況和缺血區Caspase-3蛋白表達。

1.4梗死體積測定 各組大鼠分別在再灌注后6、12、48 h時間點斷頭處死，3 min內取腦，把腦取出后去掉小腦、低位腦干和前部嗅球，保留大腦半球，從前到后每隔2 mm切為厚薄均勻的5～6片。置于2%TTC中37℃水浴30 min左右。可見正常腦組織著色為深粉紅色，梗死部分不著色為白色。用數碼相機拍照后輸入計算機，用圖像分析軟件計算梗死面積。

1.5檢測缺血區TUNEL法檢測神經細胞凋亡情況 各組大鼠分別在再灌注6、12、48 h麻醉，打開胸腔，完全暴露心臟，由左心室插入20號針頭，剪開右心耳，生理鹽水灌注后見大鼠四肢、眼睛、口唇黏膜逐漸變為白色，右心耳流出澄清液體后繼續用4%多聚甲醛250 ml灌注固定，可見灌注過程中大鼠的四肢及頭尾逐漸僵硬。5 min內取腦，去掉小腦、低位腦干和前部嗅球后放入新鮮配置的4%多聚甲醛中固定至少24 h。固定后的腦從前到后每隔2 mm切5～6片，取中間一片常規乙醇梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋。包埋后組織塊連續冠狀切片，片厚約7 μm，買個鼠腦取2張切片TUNEL法檢測凋亡。

1.6缺血再灌注后Caspase-3表達 各組大鼠制備模型及取材同TUNEL檢測神經凋亡細胞組，石蠟切片常規脫蠟后嚴格按照試劑盒的說明書進行操作。胞漿被染成棕褐色為陽性細胞。應用MetaMorph顯微圖像分析系統測定額頂葉皮質神經細胞胞漿的灰度值，染色越深，其值越小，反映胞質內蛋白表達越高，每張切片隨機選擇5個視野檢測灰度值和計數陽性細胞，取其平均值代表每只大鼠的陽性表達程度。

2 結 果

2.1不同時間點各組大鼠腦梗死體積 假手術組各時間點大鼠未見腦梗死發生。與假手術組比較，模型組各時間點腦梗死體積均有明顯增高(P<0.05)，模型組隨梗死時間的延長，梗死體積也隨之增加(P<0.05)，使用依達拉奉治療后，各時間點梗死體積均明顯減小(P<0.05)。見表1。

2.2不同時間點各組大鼠神經細胞凋亡情況 假手術組各時間點大鼠僅見微量神經細胞凋亡出現。與假手術組比較，模型組各時間點大鼠神經細胞凋亡明顯增多(P<0.05)，且在再灌注12 h后神經細胞凋亡最明顯(P<0.05)，使用依達拉奉治療后，各時間點梗死體積均明顯減小(P<0.05)。見表2。

2.3不同時間點各組大鼠腦組織Caspase-3表達 與假手術組各時間點比較，模型組大鼠腦組織Caspase-3表達明顯增多(P<0.05)，使用依達拉奉治療后，各時間點大鼠腦組織Caspase-3表達明顯下降(P<0.05)。見表3。

表1 各組大鼠各時間點腦梗死體積

表2 各組大鼠各時間點神經細胞凋亡情況

表3 各組大鼠各時間點腦組織Caspase-3表達

3 討 論

目前認為在梗死中心神經細胞死亡的形式為壞死，而導致梗死半暗帶神經細胞損傷的形式為細胞凋亡〔2〕。細胞發生凋亡還是死亡由多種因素決定，包括損傷程度、Ca2+超載程度、細胞內ATP水平以及Caspase-3激活程度。凋亡細胞主要存在于缺血半暗帶，提示凋亡可能影響最后腦梗死的面積〔3〕。而在缺血再灌注后0.5 h可出現凋亡細胞，24～48 h達到高峰，最長可持續到28 d。凋亡細胞的數量隨缺血時間的延長而增多〔4～6〕。凋亡是各種凋亡刺激信號使動，受細胞內源性基因、酶類和信號傳導途徑等調控的瀑布式級聯激活過程，其中蛋白酶與細胞凋亡密切相關。而凋亡的發生由Caspase家族成員介導的蛋白酶級聯反應過程。Caspase家族在凋亡細胞的死亡中扮演了重要角色。Caspase-3酶原與CED-3蛋白有35%的一致性，58%的相似性，Caspase-3是Caspase家族中14個成員中，與凋亡關系最密切的，是Caspase級聯瀑布反應下游最關鍵的凋亡執行蛋白酶，在各種因素的凋亡程序中起最后樞紐作用。

隨著對腦缺血再灌注損傷病理生理機制的研究，目前認為腦缺血再灌注可引起腦內一系列的生化改變，其中自由基過量蓄積是造成腦缺血再灌注后神經組織損傷的重要環節，這已被廣泛認可〔7〕。依達拉奉是目前唯一在臨床上使用的自由基清除劑，實驗證明依達拉奉具有以下功能：清除缺血/再灌注后腦內具有高度毒性的羥基集團，一直腦缺血后梗死區遲發性神經元死亡，一直脂質過氧化，縮小梗死體積，抑制炎癥介質白三烯的形成，減輕腦水腫，減少細胞凋亡。

本研究結果顯示隨著再灌注后時間的推移，凋亡細胞數逐漸增加，梗死體積增大，Caspase-3蛋白表達增多，提示神經元凋亡數增加以及Caspase-3蛋白表達增加與梗死體積增大有明顯的相關性。

4 參考文獻

1Longa EZ，Weinstein PR，Calson S，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989；20：84.

2Kogure T，Kogure K.Molecular and biochemic events within the brain subjected to cerebral ischemia targets for therapeutical intervention 〔J〕. Clin Neurosci，1997;4 (3)：179-83.

3Guegan C，Boutin H，Boudry C,etal.Apoptotic death in cortical ileuroils of mice subjected to focal ischemia〔J〕.C RA Cad Sci，1996;19 (10) ：879-85.

4Rami A，Jansen S，Giesser L,etal.Post-ischemic activati on of caspase-3 in the rat hippocampus：evidence of an axonal and dendritic iocalization〔J〕.Neurochem Int，2003；43(3)：211-23.

5吳 旭，王保捷，張國華，等.大鼠腦損傷后Caspase-3表達的時間規律性研究〔J〕.中國醫科大學學報，2004；33(4)：324-7.

6王宇卉，邵福源，夏春林，等.大鼠大腦中動脈缺血-再灌注模型中Caspase- 3的表達〔J〕.臨床神經病學雜志，2003;16(4)：214-9.

7Sweeney ML.Neuroprotective effects of adenosine incerebral ischemia：window of opportunity〔J〕. Neurosci Biobehav Rev,2004;21(2):207.