人端粒酶逆轉錄酶siRNA誘導宮頸鱗癌耐藥細胞株SiHa/DDP凋亡的分子機制研究

王 藝 陳金石 李隆玉 李 凌

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其中宮頸鱗癌約占80%～90%。雖然目前對于宮頸鱗癌的治療效果取得了顯著進步，但晚期及復發性宮頸鱗癌患者治療效果及預后卻不夠理想。隨著惡性腫瘤多學科綜合治療模式的轉變，基因治療倍受矚目。因此，探索宮頸鱗癌基因治療具有重大意義。本研究將hTERT SiRNA導入耐藥宮頸鱗癌SiHa/DDP細胞株后，采用實時熒光定量PCR檢測hTERT mRNA含量、流式細胞儀檢測細胞凋亡、MTT法檢測細胞凋亡變化，并將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸鱗癌耐藥細胞株SiHa/DDP：由四川大學華西第二醫院西部婦幼醫學研究院遺傳實驗室劉珊玲教授惠贈。hTERT SiRNA由Invitrogen公司構建。

1.2 方法

1.2.1 引物設計和合成 目的基因hTERT及內參照基因的PCR引物采用Primer5引物設計軟件，并經GeneBank Blast進行同源性比較，確定其特異性，引物序列：hTERT上游引物，5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；下游引物，5’-CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3’；GAPDH上游引物，5’-CGTGGTTTCTGTGTGGTGTC-3’；下游引物，5’-CCTTGTCGCCTGAGGAGTAG-3’。由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.2.2 細胞實驗分組 實驗分為4組：空白對照組(A組)，脂質體對照組(B組)，Negative Control siRNA對照組(C組)，轉染組(D組)[hTERT SiRNA與脂質體混合液轉染SiHa/DDP細胞組(熒光定量PCR檢測各組細胞hTERT mRNA實驗時，該組有SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3 3小組)]。不同時間點收集各組細胞進行相關檢測，重復3次，每個指標檢測設置3復孔。

1.2.3 SiHa/DDP細胞培養 培養瓶含有10%胎牛血清的DMEM培養液，每毫升加2微克順鉑的混合液，置37 ℃、5% CO2細胞培養箱中常規培養。

1.2.4 設計并化學合成hTERT siRNA 根據Genebank中的hTERT基因序列，遵守siRNA設計原則并參考相關文獻，設計了三對長度均為21bp的siRNA鏈，并由美國Invitrogen公司上海分部協助合成，Negative Control siRNA正義鏈，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’；反義鏈，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’。SiRNA-1正義鏈，5’-GGAGCAAGUUGCAAAGCAUTT-3’；反義鏈，5’-AUGCUUUGCAACUUGCUCCTT-3’。SiRNA-2正義鏈，5’-GGAACACCAAGAAGUUCAUTT-3’；反義鏈，5’-AUGAACUUCUUGGUGUUCCTT-3’。SiRNA-3正義鏈，5’-GCACCAACAUCUACAAGAUTT-3’；反義鏈，5’-AUCUUGUAGAUGUUGGUGCTT-3’。序列經檢索證實與其它基因無同源性，siRNA帶有綠色熒光蛋白作標記。

1.2.5 hTERT SiRNA轉染SiHa/DDP細胞 實驗步驟如下：①種板：轉染前一天，以(4～6)×105/孔的密度將細胞轉種到6孔板中，加入1 ml無抗生素培養基，并保證轉染時的細胞密度為70%～85%。② hTERT siRNA和脂質體的配置：依照轉染試劑說明書，轉染當天用EP管把干粉裝10 OD siRNA離心→加300 μlDEPC水(獲得10 μM濃度siRNA300 μl，此時10 μlsiRNA溶液含siRNA100 pmol)→加120 μl ployfectine轉染試劑輕輕搖晃混勻，室溫靜置15 min。③孵育siRNA脂質體溶液同時用無血清培養基洗滌待轉染的細胞3次，然后于每孔中加入1.0 ml無血清培養基培養。siRNA脂質體溶液孵育15 min后，轉移至6孔板中，輕輕搖動，置培養箱孵育5 h后更換完全培養基。24 h后取出6孔板，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白估計轉染效率，選擇熒光監測效果明顯的處理孔完成后面實驗。

1.3 hTERT mRNA含量檢測

試劑盒購于美國Invitrogen公司，具體操作按試劑盒說明書進行，實驗過程：總RNA的提取，然后去除基因組DNA，再行逆轉錄，然后采用Real-time PCR檢測hTERT mRNA含量，本實驗設計了三對長度均為21bp的siRNA鏈 轉染細胞，并檢測各轉染組hTERT mRNA表達，然后選取對hTERT mRNA表達抑制效果最明顯的siRNA鏈(siRNA-1)進行后續實驗。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

取轉染后的細胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化制備成單細胞懸液，將細胞分散于200 ml的PBS緩沖液中，用4 ℃預冷的PBS分別洗滌待檢測細胞兩次，用吸管吸盡PBS。加入2 ml預冷的70%乙醇，4 ℃固定細胞抗原；250 μL Binding Buffer重懸細胞，轉移懸液至EP管，用100 μL Binding Buffer充分潤洗六孔板殘留細胞，轉移至EP管，往EP管加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL 20 μg/mL的PI，混勻后避光，室溫反應20 min，加PBS400 μL稀釋細胞，調整細胞濃度為(5～6)×105/ml，應用流式細胞儀檢測分析，通過軟件分析細胞凋亡率。

1.5 MTT法檢測hTERT SiRNA轉染后SiHa/DDP細胞生長抑制變化

選取貼壁80%～90%的六孔板，消化。各處理組細胞懸液分別以100 μL接種于96孔平底細胞培養板，每個濃度設3個復孔；同時設調零孔和細胞對照孔。將96孔細胞培養板置于培養箱。于24 h、48 h、72 h 3個時間，于每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續培養4 h后棄上清，于每孔中加入200 μL DMSO終止反應。室溫下置于搖床振蕩10 min，結晶物充分溶解后應用酶標儀檢測OD值。應用作圖軟件OD值為縱坐標，以時間(h)為橫坐標繪制生長抑制曲線,觀測hTERT siRNA對宮頸癌耐藥細胞株SiHa/DDP的生長抑制效果。

1.6 結果判定

轉染24 h、48 h、72 h后提取各處理組細胞總RNA，進行逆轉錄，并通過實時熒光定量PCR進行定量分析，由系統自動記錄熒光曲線并分析計算出Ct值。計算方式：△Ct=Ct(hTERT)-Ct(hGAPDH)，△△Ct =(樣品Ct值-內參照Ct值)-(對照組樣品Ct值-對照組內參照Ct值)，然后取2-△△Ct代表被檢樣品初始hTERT mRNA含量。MTT設置酶標儀490 nm波長處檢測細胞OD值。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 觀察熒光細胞

熒光顯微鏡下觀察，未轉染的細胞無熒光，而轉染的SiHa/DDP細胞可見有綠色熒光。

2.2 轉染后hTERT mRNA表達水平的檢測

2.2.1 不同siRNA對SiHa/DDP細胞hTERT表達水平的抑制作用 hTERT siRNA轉染SiHa/DDP細胞24 h后，實時熒光定量PCR檢測各組細胞hTERT mRNA，結果siRNA-1、siRNA-2和SiRNA-3轉染組細胞的hTERT mRNA表達量均顯著下降:設定空白對照組為1，其各組細胞hTERT mRNA相對表達量(即拷貝數與內參基因拷貝數比值)均值分別為：SiRNA-1組(0.249±0.019)、SiRNA-2組(0.273±0.028)、SiRNA-3組(0.350±0.017)、Negative Control siRNA組(0.931±0.036)、脂質體對照組(0.956±0.052)(圖1)。單因素方差分析結果顯示：SiRNA-1組、SiRNA-2組、SiRNA-3組hTERT mRNA相對表達量分別與Negative Control siRNA組、脂質體組及空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。SiRNA-1組hTERT mRNA相對表達量與SiRNA-2組、SiRNA-3組相互比較差異無統計學意義(P>0.05)；Negative Control siRNA組、脂質體對照組及空白對照組相互比較差異無統計學意義(P>0.05)。可見SiRNA-1組、SiRNA-2組、SiRNA-3組hTERT mRNA相對表達量較各未轉染對照組均明顯下降，說明3個構建的SiRNA片段均有良好抑制效果，三組片段間無明顯差異，選取對hTERT mRNA表達抑制效果最強的siRNA-1進行后續實驗。

圖1 轉染24 h后轉染組及各對照組hTERT mRNA相對表達量

2.2.2 siRNA-1對SiHa/DDP細胞hTERT表達水平的抑制作用 轉染48 h及72 h后繼續檢測siRNA-1轉染組、Negative Control siRNA組、脂質體組及空白對照組hTERT mRNA含量。同理用2-△△Ct公式計算被檢樣品hTERT mRNA含量，其他各組細胞hTERT mRNA相對表達量均值與空白對照組比較，48 h分別為：siRNA-1組(0.138±0.009)，Negative Control siRNA組(0.940±0.025)，脂質體組(0.961±0.037)，siRNA-1組hTERT mRNA相對表達量與各對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。72 h分別為：siRNA-1組(0.174±0.016)，Negative Control siRNA組(0.901±0.042)，脂質體組(0.943±0.28)；siRNA-1組hTERT mRNA相對表達量與各對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。可見siRNA-1轉染組細胞的hTERT mRNA表達量下降顯著，見圖2。

圖2 siRNA-1組及對照組hTERT mRNA相對表達量

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。轉染24 h后hTRET siRNA轉染組凋亡率為(75.83±2.18)%,與A組[(0.18±0.07)%]比較有顯著差異，而轉染48 h時轉染組凋亡率增高至(86.48±7.18)%，轉染72 h凋亡率較48 h下降(83.41±5.81)%。比較轉染24 h各組早期細胞凋亡率：siRNA-1組[(75.83±2.18)%]明顯高于C組[(2.11±0.08)%]、B組[(0.32±1.22)%]和A組[(0.18±0.07)%]，差異均有統計學意義(P<0.05)；hTRET siRNA轉染組壞死細胞和晚期細胞凋亡率[(18.02±2.71)%]同樣明顯高于C組[(2.03±0.10)%]、B組[(0.36±1.02)%]和A組[(0.08±0.02)%]，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4 MTT法檢測hTERT SiRNA轉染后SiHa/DDP細胞生長曲線

轉染24 h、48 h、72 h后分別采用MTT比色法檢測各組SiHa/DDP細胞OD490均值：siRNA-1組分別為(0.103±0.006)、(0.080±0.004)、(0.032±0.0006)；空白細胞對照組分別為(0.118±0.008)、(0.151±0.005)、(0.190±0.003)；脂質體對照組分別為(0.111±0.006)、(0.143±0.003)、(0.179±0.001)，Negative Control siRNA對照組分別為(0.110±0.004)、(0.127±0.004)、(0.168±0.005)；同一時間點各組OD490均值單因素方差分析比較，siRNA-1組明顯低于其余3組，差異具有統計學意義(P<0.05)。以OD490均值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線，見圖3。

3 討論

端粒酶是1種RNA蛋白復合體，由三個部分組成：端粒酶自身RNA模板、端粒酶逆轉錄酶(TRET)、端粒酶相關蛋白，其以自身的RNA為模板合成端粒重復序列使端粒長度得以維持[1]，而人端粒酶逆轉錄酶(telomerase reverse transcriptase,hTERT)是其活性表達的關鍵組份和限速因子[2]。端粒的主要功能是在染色體末端形成帽子結構，使染色體不會隨著復制后RNA引物的降解而縮短，也使染色體末端無有害融合，從而維持染色體結構的穩定性和完整性。Zheng等[3]研究發現宮頸病變時端粒酶被激活，宮頸上皮內瘤變(CIN)時即可檢測到端粒酶的表達,而宮頸癌時激活程度更高,發現端粒酶激活概率隨宮頸癌病變進展而升高，并認為TERC基因擴增檢測可以提供一個有效的非侵入性的方法用來評估鑒別宮頸疾病病變級別高低。Jin等[4]采用液基薄層原位雜交(FISH)細胞病理學檢查和檢測擴增的熒光在130多名婦女進行人類乳頭狀瘤病毒DNA 檢測、陰道鏡活檢和組織病理學檢查。結果人類乳頭狀瘤病毒DNA 檢測、陰道鏡活檢和組織病理學檢查均顯示在宮頸高度鱗狀上皮病變患者中hTERC基因擴增率高于宮頸高度鱗狀上皮病變患者。并認為FISH檢測hTERC基因擴增可能是區分低級別和高級別的宮頸鱗狀細胞疾病的診斷的一種有效的輔助細胞學或病理學檢查。多數學者認為，在宮頸癌組織中hTERT mRNA高表達與端粒酶激活關系密切，對宮頸脫落細胞進行端粒酶活性檢測或hTERT mRNA異常高水平表達，既可當作早期診斷宮頸癌的一個標志，還可以輔助判斷宮頸病變級別高低。

圖3 hTRET SiRNA-1對SiHa/DDP細胞體外增殖的抑制作用

我們先期有相關研究[5]針對江西省2499例30～49歲農村婦女進行了以病理為金標準的宮頸癌篩查發現在CINⅡ及以上病變hTERC基因擴增明顯；且隨著宮頸病變程度的增加,hTERC基因表達率增加。由此可見，hTERC基因異常的染色體不穩定性與宮頸癌的發生關系密切。可見hTERT與宮頸癌密切關系，但通過hTERT SiRNA手段對宮頸鱗癌細胞凋亡實際效果的細胞及分子水平的研究報道較少。hTERT作為端粒酶的關鍵組分維持端粒長度，能直接參與腫瘤細胞增殖和生長的調控，它的表達受多個水平多個因子精密調控，與宮頸鱗癌的臨床病理指標具有相關性，是宮頸癌基因干擾實驗的良好靶基因。通過有效siRNA片段抑制hTERT表達能抑制細胞生長增殖并促進凋亡，至于siRNA轉入細胞后作用場所這點目前尚無定論，有研究支持是在細胞核內作用[6]，有研究認為其限于在細胞漿作用[7]，具體明確還待進一步研究。

靶向RNA干擾對腫瘤的端粒酶的抑制作用是一個多階段、多因素的復雜過程，目前端粒酶分子機制尚未被完全明確。此外，端粒的延長也還存在著不依靠端粒端粒酶活性的方式。因此可以推測不可能所有類型的腫瘤對端粒酶抑制劑產生良好的抑制反應。而且在細胞周期的不同階段的端粒酶活性各不相同，如何在不同的階段的腫瘤細胞進行有針對性的抗端粒酶治療，這也仍然是一個問題。已有的靶向治療端粒酶研究多針對體外各種細胞系的，動物模型研究相對缺乏，因此建立合適的動物模型進行研究是一個迫切的問題。目前的RNAi靶向端粒酶大部分主要是抑制端粒酶的單個組件，因此這不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長，隨后的RNA干擾技術的研究應該考慮利用同一基因家族的多個基因有的同源片段，因為此片段有高度保守的特性，所以如果成功設計出有效的同源序列的siRNA分子片段，則有可能實現在同一時間較強效果地除去各期端粒酶活性。即便如此，RNA干擾技術在腫瘤基因靶向治療完全抑制端粒酶活性的實際臨床應用仍然有很多目前尚未解決的難題。雖然目前有多種siRNA的體內遞送方法，但它們應用于人體臨床治療的安全性仍然是一個重大的問題。

[1] Masaharu A,Osamu Y,Naotoshi K,et a1.Telonlerase overelpression in K562 leukemia cells protects against apoptosis by serum deprivation and double-slranded DNA break inducing agents,but not against DNA synthesis inhibitors〔J〕.Cancer Lett,2002,178(2):187-197.

[2] Massaki S,Fumihiko K,Hisashi H,et al.Detection of telomerase activity,telomerase RNA component,and telomerase reverse transcriptase in human hepatocellular carcinoma〔J〕.Science,2004,29(1):31-38.

[3] Tu Z,Zhang A,Wu R,et al.Genomic amplification of the human telomerase RNA gene for differential diagnosis of cervical disorders〔J〕.Cancer Genet Cytogenet,2009,191(1):10-16.

[4] Jin Y,Jia-Ping L,Dan H,et al.Clinical Significance of Human Telomerase RNA Gene (hTERC) Amplification in Cervical Squamous Cell Lesions Detected by Fluorescence in Situ Hybridization〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2011,12(5):1167-1171.

[5] 李 凌，江 維，李隆玉,等.熒光原位雜交技術檢測hTERC基因預測宮頸上皮內瘤樣病變1級自然轉歸的前瞻性研究〔J〕.中國腫瘤臨床，2013,40(1)：25-28.

[6] Jose Emesto B,Dayson Friaca M.RNA interference against human cancers:a perspective〔J〕.Applied Cancer Res,2009,29(4):512-514.

[7] Zhongji M,Song Q,Xiaoyong Z,et al.Inhibition of woodchuck hepatitis virus gene expression in primary hepatocytes by siRNA enhances the cellular gene expression〔J〕.RNA,2009,384(1):88-96.