CXCL12蛋白表達在鼻咽癌組織中的臨床意義

羅慶豐 李金高 張小芳 付愛榮 齊淑軼 黃先明 張 科

鼻咽癌是常見多發的惡性腫瘤,放化療綜合治療是近期主要的治療方式,失敗的主要原因是局部復發，我們通過研究鼻咽癌的患者腫瘤局部的免疫狀態，探索腫瘤復發機制，預測腫瘤的預后因子，降低復發的發生率，提高患者的生存質量和生存時間，改善治療效果，為鼻咽癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2006年3月-2007年5月收集98例在江西省腫瘤醫院院治療的鼻咽癌患者，其中男性54例，女性44例，年齡27～70歲，中位年齡56歲；患者均經病理檢查證實為鼻咽非角化癌，收集患者5年隨訪資料。

1.2 主要試劑和方法

1.2.1 試劑 CXCL12蛋白單克隆抗體(即用型)及MaxvisionTM免疫組化試劑盒購自英國Abcam公司，CXCL12蛋白為工作液，參考滴度1∶100。

1.2.2 方法 CXCL12蛋白標記檢測采用MaxvisionTM免疫組化法，操作按說明書進行：① 4 μm連續切片，裱于涂有APES的載玻片上，70 ℃烤片2 h;② 二甲苯脫蠟，梯度酒精入水；③ 3%過氧化氫室溫孵育30 min，消除內源性過氧化物酶；④ 抗原修復：切片浸于pH 6.0檸檬酸溶液中，電飯鍋中煮沸5 min，保溫10 min，自然冷卻；⑤ PBS洗,3 min×2次；⑥ 加入CXCL12抗體，4 ℃冰箱12 h；⑦ 復溫，PBS洗去一抗3 min×2次；⑧ 滴加Maxvision試劑，室溫作用1 h；⑨ PBS洗3 min×2次；⑩ DAB光鏡下顯色，蘇木精復染，封片。光鏡下觀察CXCL12蛋白在鼻咽癌組織中表達。陽性對照：購自英國Abcam公司CXCL12蛋白乳腺癌陽性組織片。陰性對照：PBS代替一抗。

1.2.3 結果判斷 細胞胞質呈棕黃色顆粒沉著者為CXCL12蛋白陽性表達。選擇CXCL12蛋白陽性表達熱點區的4個高倍視野，記數400個以上細胞，根據陽性細胞數及細胞染色強度進行半定量，根據著色強度及顯色癌細胞比例將染色結果分為-、+、++和+++。染色強度評分方法為：無著色計0分；染色為淺棕色計1分;染色為棕色計2分;染色為棕褐色計3分。陽性細胞百分比:無陽性細胞計0分;陽性細胞數<10%計1分;10%～<50%計2分;50%～<75%計3分;≥75%計4分。由兩名病理科醫師獨立閱片完成,核對結果,取得共識。上述兩項結果之乘積為最后評分結果，結果分為：①陰性表達，<4分為(-);②陽性表達，≥4～<6分為(+),≥6～<9分為(++),9≥～<12分為(+++)。

1.3 治療方法

按國際抗癌聯盟 UICC 2003 版鼻咽癌分期標準對患者進行臨床TNM分期，根據分期結果確定治療方案。放射源為直線加速器治療機，采用常規分割方法。98例均完成同期化療和放射治療，放療劑量為鼻咽部66～72 Gy/33～36次/7～8周，頸部轉移淋巴結60～70 Gy/30～35次/7～8周，頸部的預防照射劑量46～50 Gy/23～25次/5～6周。同期采用PF方案化療：順氯氨鉑20 mg/m2和5-氟尿嘧啶500 mg/m2，靜脈滴注，連用5天。

1.4 療效評價方法

應用WHO實體瘤近期療效評定標準，放療結束時根據CT檢查結果評價即時療效，分為CR和PR。

1.5 統計方法

應用SPSS 16.0統計軟件進行分析， 生存率采用Kaplan-Meier分析。

2 結果

2.1 CXCL12蛋白表達與鼻咽癌臨床病理特征的關系

CXCL12蛋白表達與鼻咽癌病理組織亞型無相關性，CXCL12蛋白表達與淋巴結轉移密切相關，淋巴結轉移患者CXCL12陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移者(P<0.05)；CXCL12蛋白表達與鼻咽癌TNM及治療療效顯著相關(P均<0.05)，見表1。

表1 CXCL12蛋白表達與鼻咽癌臨床病理參數的關系/例

2.2 CXCL12蛋白陽性表達與鼻咽癌患者5年生存率的關系

CXCL12蛋白陰性者5年生存率為68.8%，CXCL12蛋白陽性者5年生存率為43.9%，兩者比較具有顯著性差異(log-rank，χ2=6.07，P=0.01，P<0.05)，見圖1。

3 討論

鼻咽癌是常見多發的惡性腫瘤,大多數患者確診時為中晚期，轉移與浸潤是鼻咽癌的治療與預后主要因素，我們通過研究鼻咽癌患者腫瘤局部的微環境狀態，檢測鼻咽癌中趨化因子(CXCL12)表達狀態，預測腫瘤的治療和預后因素，探索鼻咽癌復發機制。

趨化因子(CXCL12)是一類最早被發現控制免疫細胞向炎癥定向遷移的細胞因子,其功能由相應受體介導,與高遷移率族蛋白1(HMGB1)結合后可產生誘

圖1 CXCL12蛋白陽性表達與鼻咽癌患者5年生存率的關系

導靶細胞趨化性遷移等多種生理功能[1]。趨化因子及其受體在多種腫瘤細胞呈高表達,與惡性腫瘤的生長、侵襲和轉移密切相關。

CXCLl2基因位于10號染色體長臂，是高度保守的G蛋白偶聯的跨膜受體。在胚胎的發育、干細胞的遷移和各種免疫反應中起重要作用，是許多生理和病理過程中指導細胞運動的中心因素，調節細胞的增殖[2-3]。CXCLl2和相應受體CXCR構成的生物學軸在多種腫瘤的生長、轉移中發揮重要調節作用，趨化因子能通過刺激腫瘤細胞生長，趨化腫瘤細胞以及促進血管生長和消化細胞外基質的間接作用促進腫瘤的的生長和轉移[4]。腫瘤細胞的遷移是由其所表達的趨化因子受體和靶器官表達的趨化因子所決定，與腫瘤的新生血管的形成有關，而CXCLl2和CXCR結合物在惡性腫瘤的生長與轉移過程中，主要是促進腫瘤血管的形成，進而調控腫瘤細胞生長增殖，Salvucci等[5]研究表明閉血管內皮生長因子及堿性成纖維細胞通過抗CXCLl2-CXCR4抗體阻斷CXCLl2-CXCR4的功能或iRNA技術使得CXCLl2-CXCR4基因沉默，可抑制血管生長因子依賴的血管生成，從而抑制腫瘤的生長。

本研究中CXCLl2陽性表達患者轉移率高于陰性表達患者，且與臨床分期密切相關提示CXCLl2的表達增高與鼻咽癌生長增殖和轉移有關。該研究結果與Lshigami等[6]和Yasumoto等[7]關于胃癌的研究結果一致，CXCL12作為1種與腫瘤侵襲、轉移密切相關的因子，可為鼻咽癌的腫瘤預后標記物之一。CXCLl2陽性表達患者5年生存率明顯低于陰性表達者，因此根據患者腫瘤組織CXCLl2表達情況，給與個體化的綜合放化療輔助治療，提高患者的生存率。

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