CIK細胞治療晚期大腸癌的臨床研究

方慧云 程偉民 李曉玲 季明芳

大腸癌(colorectal cancer，CRC)包括結腸癌和直腸癌，是常見的消化道惡性腫瘤之一，全世界大腸癌的發病率處于惡性腫瘤的第三位[1-2]。目前主要是手術、放療和化療，但是這些方法對于晚期患者效果并不理想。隨著分子生物學及基因工程技術的不斷發展，CIK細胞過繼免疫治療已成為腫瘤治療的第四模式。本研究是將CIK細胞行體外誘導培養后，回輸患者體內，并隨機抽出30例未行CIK治療的晚期大腸癌患者，進行比較，觀察其療效。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集經確診的、并發生轉移的、且采用標準治療方案(手術、放療和化療)治療的晚期大腸癌患者作為觀察組(30例)，取其外周血分離單個核細胞(PBMC)，體外細胞因子誘導培養CIK細胞，應用流式細胞儀檢測細胞表型，30例患者均接受CIK細胞免疫治療，觀察其免疫活性、無進展生存期及生存期。以30例僅采用標準治療方案而未經CIK治療的晚期大腸癌患者作為對照組。兩組性別、年齡無顯著差異。

1.2 試劑

GT-T551無血清培養基購自TaKaRa生物技術有限公司，培養用IL-2、CD3McAb、IL-1、IFN-γ均為R&D公司產品，流式細胞儀標記抗體CD3、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+為BeckmanCoulter產品。

1.3 細胞培養和誘導

CIK細胞的體外誘導和擴增：采集患者外周血50ml，用淋巴細胞分離液(Ficoll)分離出PBMNC，GT-T551無血清培養基調細胞濃度為(4 - 6 )×106/ml，并加入1 000 U /ml的IFN-γ懸浮培養，培養液15 ml，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，24 h后加入1 μg/ml的CD3單克隆抗體和1 000 U /ml的IL-1，48 h后補加液至50 ml，補充CD3單克隆抗體。第4天繼續補加液至80 ml，培養第5天分成3瓶，第7天轉移至培養袋，每2天加液1次，液量為500 ml。

1.4 流式細胞儀檢測

待細胞培養15天后，應用流式細胞儀檢測CIK細胞表面分子，CIK細胞是以CD3、CD4、CD8細胞為主的異質性細胞，CD3 和CD8細胞百分率隨培養時間的延長而增高，CD3分辨率>80%，CD3+CD56+分辨率>20%。

1.5 治療方法

細胞培養第15天開始回輸患者體內，細胞分5次回輸，細胞總量不少于1010。輸注過程中要嚴格按照無菌操作程序，沖洗輸液管道的鹽水量不必太多，輸前口服消炎痛，出現發熱寒戰等癥狀應停止回輸，并采取應對措施。

1.6 免疫指標的檢測

觀察組患者在治療前后檢測外周血T淋巴細胞亞群(CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+，CD3+CD56+)和NK細胞(CD56+)變化。

1.7 毒性反應監測

觀察組患者在每次治療后6 h內觀察包括(過敏反應和變態反應等急性毒性反應)；每2周檢查患者血常規、肝腎功能，以觀察治療的慢性毒性反應。

1.8 隨訪項目

觀察兩組患者無進展生存期及生存期。

1.9 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。

2 結果

2.1 CIK細胞回輸后不良反應

3例患者有輕度畏寒、發熱等癥狀，體溫37.5～38 ℃，一般回輸1～2 h后出現，歷時2～6 h，可自限性。

2.2 CIK細胞治療后外周血T淋巴細胞亞群及NK細胞變化

CIK細胞治療后，發現CD3+、CD3+CD4+、CD56+(NK)效應細胞的比率和CD4+/ CD8+比值顯著上升，而CD3+CD56+效應細胞的比率下降，見表1。

表1 CIK細胞治療前后T淋巴細胞亞群及NK細胞水平

2.3 預后

觀察組發生轉移后無進展生存期為(50.9±10.8)個月，對照組無進展生存期為(26±8.3)個月，差異有統計學意義(P<0.05)。

觀察組發生轉移后生存期為(62.5±13.8)個月，對照組為(35.6±10.2)個月，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

我國大腸癌發病率呈逐年上升趨勢，尤其是結腸癌的發病率迅速上升。大多數患者就診時已達中晚期，采用標準治療方案已沒有明顯效果。CIK細胞是1種新型的免疫活性細胞。它是將人外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞[3-4]，具有增值速度快、殺瘤譜廣、殺瘤活性高等優點；配合化療、放療，可提高腫瘤患者對放化療的耐受性，提高腫瘤的治療效果；晚期腫瘤患者單純采用CIK治療，可以消除、減小腫瘤，提高免疫力和患者生存率以及生活質量。

CIK細胞是多種細胞因子共同誘導培養的細胞，多種細胞因子的作用是相互協同，單一薪資對效應細胞的增殖及細胞毒活性小于多種細胞因子的聯合作用?？笴D3單克隆抗體(CD3McAb)作為1種有絲分裂促進劑可促進細胞增殖，具有抗腫瘤轉移的作用。γ-干擾素(IFN-γ)可通過多種途徑直接或間接發揮抗腫瘤作用。在誘導CIK細胞形成過程中加入IFN-γ可降低IL-2用量，且先加入IFN-γ后加入IL-1可提高細胞毒活性，因為先加入IFN-γ可促使PBMC上IL-2受

體數量增加，從而有效地激活效應細胞。白細胞介素-1(IL-1)主要由激活的單核巨噬細胞產生，它可以介導外周單個核細胞上表達IL-2受體，與IFN-γ、CD3McAb合用時可以明顯提高CIK的細胞毒效應，但IL-1對CIK擴增不起作用[5]。白細胞介素-2(IL-2)是T淋巴細胞分泌的1種細胞因子，具有免疫增強、抗腫瘤和抗感染的作用。

CIK細胞殺傷靶細胞的機制：與靶細胞的結合階段，通過靶細胞表面分子和效應細胞表面的受體相結合；致死性打擊階段，CIK細胞激活后釋放毒性顆粒和分泌細胞因子，從而導致腫瘤細胞的裂解；靶細胞溶解階段。本研究結果顯示，30例晚期大腸癌患者通過CIK 治療后，免疫功能增強，無進展生存期及生存期延長。目前，晚期大腸癌患者在接受標準治療后，聯合細胞免疫治療，可緩解病情，改善患者的生存質量，提高生存率。

[1] Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008〔J〕.CA Cancer J Clin，2008，58(2)：71-96.

[2] 吳東升，李明峰.大腸癌的靶向治療〔J〕.實用癌癥雜志，2006，21(6)： 654-656.

[3] 應敏剛，魏植強，楊建偉，等.結直腸癌術后放化療聯合DC-CIK的療效分析〔J〕.實用癌癥雜志，2010，25(3)： 274-276，282.

[4] Nagaraj S，Ziske C，Schmidt-Wolf IG.Human cytokine-induced killer cells have enhanced in vitro cytolytic activity via non-viral interleukin-2 gene transfer〔J〕.Genet Vaccines Ther，2004，2(1)：12.

[5] Zhang YS，Yuan FJ，Jia GF，et al.CIK cells from patients with HCC possess strong cytotoxicity to multidrug resistant cell line Bel-7402/R〔J〕.World J Gastroenterol，2005，11 (22)：3339-3345.