Real time-PCR檢測循環DNA基因對原發性肝癌的臨床診斷價值

郭麗萍

原發性肝癌(prjmary hepatic cancer，PHC)是肝細胞或肝內膽管細胞發生癌變導致的肝癌，是消化系統最為常見的惡性腫瘤，主要包括肝細胞癌(hepatic cellular cancer，HCC)、肝內膽管細胞癌(intrahepatic bile duct cellular cancer，ICC)和肝細胞癌-肝內膽管細胞癌混合型等不同病理類型，其中90%患者為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。目前血清AFP是診斷肝癌(HCC)的重要指標和特異性最強的腫瘤標記物，國內常用于肝癌的普查、早期診斷、術后監測和隨訪；在本研究中，我們采用real time-PCR方法，通過檢測血漿循環DNA載量表達情況，探討循環DNA的臨床早期篩查價值，為循環DNA作為原發性肝癌早期篩查腫瘤標志物提供科學實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2008年6月至2013年6月于我院收治的肝病患者，根據《中國常見惡性腫瘤診療規范》第二分冊原發性肝癌或《原發性肝癌診療規范(2011年版)》診療標準，經臨床癥狀、影像學檢查、腫瘤標志物及病理檢查診斷為原發性肝癌后確定為研究對象[2-3]。經診斷符合本研究目的患者共63例，男性41例(65.1%)，女性22例(34.9%)，平均年齡為(58±19.6)歲，其中有淋巴結轉移者36例(57.1%)。此外選取25例經體檢健康的志愿者作為正常對照組，平均年齡為(56±18.6)歲。

1.2 血漿DNA提取

無菌采取研究對象患者組及對照組志愿者血液2～3 ml，分離血漿，根據天根DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書提取血液基因組DNA，-20℃保存備用。

1.3 引物及熒光探針設計合成

根據已發表文獻選取β-globin 基因(GenBank ID:U01317)作為目的基因分析循環DNA血液載量，引物為，β-globin-F：5’-GTG CAC CTG ACT CCT GAG GAG A-3’；β-globin-P：5’-CCT TGA TAC CAA CCT GCC CAG-3’；Taqman熒光探針：5’-(FAM)AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GG(TAMAAR)-3’。上述所有引物序列均由Invitrogen(北京)公司合成。

1.4 循環DNA real time-PCR載量檢測

Real-Time PCR檢測原發性肝癌患者和對照組志愿者人群循環DNA血漿載量，采用ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR儀(Lifetechnology公司，美國)和TransStart?Probe qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)，按試劑盒實驗說明書推薦體系(20 μl)及說明書中的PCR(三步法)進行實驗；采用ABI Taqman質控試劑盒(Lifetechnology公司，美國)，以104ng/ml、103ng/ml、102ng/ml、101ng/ml、100ng/ml作為終濃度建立標準曲線。根據real time-PCR檢測樣品Ct值及標準曲線，計算原發性肝癌患者和對照組志愿者血漿循環DNA載量，比較原發性肝癌患者確診前后血漿循環DNA含量、原發性感染淋巴結轉移前后血漿循環DNA含量，及與對照組血漿DNA含量的比較。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 原發性肝癌確診前后血漿循環DNA載量變化

檢測原發性肝癌患者確診前24個月及確診后血漿循環DNA的變化，行對比分析，結果顯示：原發性肝癌患者確診后的血漿循環DNA載量顯著高于確診前(P<0.01)，也顯著高于對照組(P<0.01)；確診前6個月血漿循環DNA載量顯著高于確診前12個月、18個月、24個月及對照組的(P<0.01)；確診前12個月、18個月、24個月血漿循環DNA載量與對照組相比，雖無統計學差異(P>0.05)，但數值上也高于對照組，且確診前24個月至確診前12個月血漿循環DNA載量呈上升趨勢，無統計學差異(P>0.05)(表1，圖1)。

表1 原發性肝癌患者確診前后及對照組血漿循環DNA載量

圖1 原發性肝癌患者確診前后及對照組血漿循環DNA載量

2.2 原發性肝癌有無淋巴結轉移患者間血漿循環DNA載量比較

比較有淋巴結轉移的原發性肝癌患者和無淋巴結轉移肝癌患者血漿DNA載量，結果顯示：有淋巴結轉移原發性肝癌患者血漿DNA載量[(79.3±13.7 )ng/ml]顯著高于無淋巴結轉移原發性肝癌患者[(52.1±12.5)ng/ml]，經統計學分析,P<0.01，兩組間差異顯著(圖2)。

圖2 原發性肝癌有無淋巴結轉移患者間血漿循環DNA載量比較

3 討論

循環DNA(circulating DNA)又稱循環核酸，是1種游離于細胞外的、存在于各種體液中的DNA。Mandel和Metais于1947年最早發現了循環DNA的存在，但是受當時實驗條件和方法的限制并沒能查明其余疾病的關系[4]。1977年，Leon等于Cancer Research雜志發表文章稱腫瘤患者血漿循環DNA載量水平顯著高于健康人群，首次闡明了血漿循環DNA與腫瘤疾病的關系[5]。隨后的研究也證實了腫瘤細胞DNA 與血漿循環DNA的關系，2種DNA之間存在著一致的基因突變[6]。1999-2003年期間召開的3次“血漿/血清循環核酸在癌癥的診斷、預后及隨訪的應用”研討會預言血漿循環DNA的檢測將為臨床腫瘤的早期篩查診斷及病程預測提供新的微創的、敏感的、特異的分子生物檢測手段。隨后的關于肺癌、乳腺癌及鱗癌的研究證實了血漿循環DNA在腫瘤病程預測及早期篩查中的作用[7]。

張博恒等利用AFP和B超檢查手段對高危人群每隔6個月進行一次肝癌篩查，結果顯示早期篩查有助于肝癌早發現，可使肝癌患者死亡率下降37%，因此，對高危人群的早期篩查是原發性肝癌早期發現的重要途徑[8]。然而，由于AFP 的敏感性和特異度不高，美國肝病研究學會(AASLD)已不再將AFP作為篩查指標。在本研究中，我們采用real time-PCR的方法檢測了血漿循環DNA在原發性肝癌臨床早期篩查和診斷的意義，結果顯示原發性肝癌確診前的24個月、18個月、12個月的血漿循環DNA載量和對照組健康人群的血漿循環DNA無顯著性差異，但是確診前6個月的血漿循環DNA顯著高于24個月、18個月和12個月的血漿循環DNA載量，而確診后的血漿DNA載量顯著高于確診前的24個月、18個月、12個月和6個月的血漿DNA載量，這些結果提示我們確診前6個月的血漿循環DNA載量具有診斷性價值，同時也提示我們血漿循環DNA載量在原發性肝癌早期篩查和診斷的臨床可行性。上述結果和任寧、張雪峰等的研究結果是一致的[7,9]。淋巴結轉移原發性肝癌患者和淋巴結未轉移患者血漿循環DNA分析結果顯示發生淋巴結轉移的原發性肝癌患者血漿DNA載量顯著高于未發生淋巴結轉移的原發性肝癌患者(P<0.01)，提示我們血漿循環DNA可以作為早期原發性肝癌篩查和診斷，以及判斷原發性肝癌病程的一個有價值的檢測指標。

在本研究中，我們的實驗結果證實了血漿循環DNA在原發性肝癌早期篩查和診斷中的價值，同時也可以用于判定原發性肝癌病程或有無淋巴結轉移；由于血清甲胎蛋白敏感性和特異性的不足，real time-PCR檢測血漿循環DNA有可能成為原發性肝癌早期篩查和診斷的一個新臨床標準。

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