MCM2基因和蛋白在乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

程甜甜 楊賢子 駱志國

MCM2屬于微小染色體維持蛋白家族(minichromosome maintenance proteins，MCMs)的成員之一。MCM2蛋白與其他家族成員形成復制前復合物可作為DNA復制的“通行證”，在所有真核細胞的DNA復制中起到重要作用[1]。我們前期的研究發現MCM2作為細胞增殖特異性標志優于常見的細胞增殖指標Ki-67，能夠更客觀和全面的反映腫瘤細胞的增殖狀態[2]。本研究通過檢測乳腺癌組織中MCM2 mRNA和蛋白水平的表達變化，進一步探討其在乳腺癌發生發展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

所有標本隨機取自2012年03月1日-2013年05月1日湖北省十堰市太和醫院乳腺外科住院患者的手術切除組織。全組病例均經病理檢查確診，其中乳腺惡性腫瘤54例，乳腺良性疾病12例，以乳腺良性疾病手術切除的正常乳腺組織(10例)作為對照組。54例乳腺惡性腫瘤包括35例浸潤性導管癌、6例乳腺導管內癌、2例乳腺小葉原位癌、3例髓樣癌、5例單純癌、其他3例。其中Ⅰ期7例，Ⅱ期14例，Ⅲ期30例，Ⅳ期3例。12例乳腺良性疾病包括乳腺纖維腺瘤、乳腺腺病、乳腺囊性小葉增生，患者術前均未行放療、化療、激素和中草藥物等治療。手術標本于-80℃凍存。

1.2 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測不同乳腺癌組織MCM2mRNA的表達

所有PCR引物均用Primer Premier 5.0軟件設計，引物序列由上海生工生物工程公司合成。MCM2引物序列上游：5’-CACGCTTTGACATCCTGTG-3’；下游：5’-TGTTGATCTGACGAGCCTTA-3’，PCR產物大小為657 bp。GAPDH引物序列上游：5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’；引物下游：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’，PCR產物大小為113 bp。分別稱取0.1 g的正常乳腺組織、乳腺良性疾病組織和乳腺癌組織，用勻漿器將組織碾磨碎后按照Trizol試劑(MRCGENE公司)說明書提取組織總RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度和濃度。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis成套試劑盒(MBI Fermentas公司)操作合成cDNA。PCR擴增條件為：95℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 30 s，共30個循環。取10 μl的擴增產物在EB染色的2%瓊脂糖凝膠中電泳。用凝膠成像掃描分析系統(英國Syngene公司的GeneGenius)測定所有條帶，應用GeneTools軟件分析所有條帶各自峰面積值,定義為該條帶的吸光度值(OD)。以GAPDH為內參照基因，MCM2基因mRNA的相對表達量則用MCM2基因(T)與內參照基因(C)吸光度值的比率(T/C OD ratio)表示。MCM2基因mRNA檢測經歷3次獨立性重復檢測。

1.3 Western blotting檢測MCM2蛋白的表達

用總蛋白提取試劑盒(Applygen公司)提取所有標本的總蛋白。簡而言之，將0.1 g的所有標本剪碎后加入1 ml裂解液，然后放入勻漿器將組織碾磨均勻。取0.5 ml組織勻漿液轉移到1.5 ml離心管。每0.5 ml組織勻漿液加入2倍體積的(1 ml)抽提試劑充分混勻。室溫或4 ℃靜置10 min后，4℃下10 000 r/min離心10 min，棄去上下層液體，無水乙醇洗滌中層蛋白膜后溶于4℅ SDS，使用BCA法蛋白含量測定試劑盒(Pierce,Rockford,IL,USA)檢測提取的蛋白濃度。取等量的蛋白(25 μg)上樣于12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠，經電泳分離后，電轉移至PVDF膜上。封閉后加入抗MCM2的一抗(美國Santa Cruz公司，按1∶300稀釋)在4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，用DAB試劑盒(北京中杉生物技術公司)顯影。MCM2蛋白檢測經歷3次獨立的重復性檢測。

1.4 統計學分析

應用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，組間比較采用獨立樣本的t檢驗(independent sample t-test)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05判定差異有統計學意義。統計數據用均數±標準差(M±SD)表示。

2 結果

2.1 正常乳腺組織和良、惡性乳腺腫瘤組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達

與正常的乳腺組織相比，良、惡性乳腺腫瘤組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達水平均增高，具有統計學差異(P<0.01)。RT-PCR和Western-blotting檢測結果發現，良性和惡性乳腺腫瘤組織之間MCM2 mRNA和蛋白的表達水平也存在統計學差異(P<0.05)。

2.2 MCM2表達與乳腺癌組織臨床分期的關系

由圖1和圖2中可以看出，不同TNM分期的乳腺癌組織中MCM2表達存在著差異。其中Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌組織MCM2 mRNA和蛋白的表達量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期的乳腺癌組織(P<0.05)，見表1。而Ⅰ期與Ⅱ期、Ⅲ期與Ⅳ期乳腺癌組織間MCM2的表達量無統計學差異(P>0.05)，見表1。

1為Marker；2為H2O對照；3為正常乳腺組織；4為乳腺良性疾病組織；5為Ⅰ期乳腺癌組織；6為Ⅱ期乳腺癌組織；7為Ⅲ期乳腺癌組織；8為Ⅳ期乳腺癌組織。

1為正常乳腺組織；2為乳腺良性疾病組織；3為Ⅰ期乳腺癌組織；4為Ⅱ期乳腺癌組織；5為Ⅲ期乳腺癌組織；6為Ⅳ期乳腺癌組織。

表1 不同TNM分期乳腺癌組織中MCM2基因mRNA的相對表達量(M±SD)

注：mRNA相對表達量為目的基因光密度(OD)與GAPDH光密度(OD)之比率。

2.3 MCM2表達與乳腺癌組織臨床病理特征的關系

由圖3和圖4可見，低、中、高分化乳腺癌組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達量存在統計學差異(P<0.05)。其中，低分化乳腺癌組織中MCM2 mRNA和蛋白的表達量較高分化的增高(P<0.01)，見表2和圖4。

表2 不同分化程度乳腺癌組織中MCM2基因mRNA的相對表達量(M±SD)

注：mRNA相對表達量為目的基因光密度(OD)與GAPDH光密度(OD)之比率。

1為Marker；2為H2O對照；3為正常乳腺組織；4為乳腺良性疾病組織；5為高分化乳腺癌組織；6為中分化乳腺癌組織；7為低分化乳腺癌組織。

1為正常乳腺組織；2為乳腺良性疾病組織；3為低分化乳腺癌組織；4為中分化乳腺癌組織；5為高分化乳腺癌組織。

3 討論

2012年中國腫瘤登記中心發布最新數據指出乳腺癌是我國女性排名第一位的惡性腫瘤，且發病率呈逐年上升趨勢，尤其是在城市。隨著醫療水平的進步，雖然我國乳腺癌的治愈率和5年生存率明顯提高，但乳腺癌的早期診斷仍不理想。因早期的腫瘤細胞增殖能力較強，故腫瘤的早期診斷主要通過對其相關的增殖標志物來判斷。目前臨床上常用的乳腺癌增殖標志物包括PCNA、Ki-67等。MCM蛋白家族是真核生物DNA復制的必需因子，在DNA復制起始和延伸過程中起到關鍵性作用[3]。Osaki等研究發現：與常用的增殖指標PCNA和Ki-67蛋白相比，MCM2蛋白能夠更敏感而更特異地反映細胞的增殖情況[4]。隨后國內外的研究發現，MCM2蛋白能夠較好的區分正常組織、不典型增生組織和腫瘤組織，可以作為結直腸癌、肝細胞肝癌、食管癌、乳腺癌等惡性腫瘤的重要生物學標志，在判斷腫瘤的惡性度及評估預后方面具有重要意義[2,5-7]。

我們前期使用免疫組化S-P法，得出MCM2在乳腺癌中的表達主要在細胞核內。MCM2在乳腺癌不同TNM分期、不同病理組織學分級(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)及淋巴結轉移之間均有顯著性差異，且呈逐漸升高趨勢。MCM2和Ki-67在乳腺癌中的表達呈平行關系(P<0.001)，且作用優于Ki-67[2]。本研究發現，MCM2在乳腺癌mRNA和蛋白水平的表達均較高，這與我們在免疫組化中得到的結果一致。這一現象提示MCM2的表達過量可能導致正常乳腺細胞不斷進入細胞周期，反復啟動DNA復制和延伸，從而使DNA突變率增加，最終導致乳腺細胞發生癌變。同時，MCM2 mRNA和蛋白的表達量在乳腺癌不同的TNM分期和不同的病理類型之間存在著統計學的差異(P<0.05)，但在Ⅰ期和Ⅱ期之間、Ⅲ期和Ⅳ期之間MCM2的表達卻無統計學差異(P>0.05)。這提示MCM2可能對反映乳腺癌細胞惡性程度和異常分化有重要的參考價值，從而可用來判斷臨床治療和預后評估等。

本研究結果從mRNA和蛋白表達水平上再次證實MCM2可能與乳腺癌的發生發展密切相關，對癌前病變、惡性程度及預后判定具有一定的臨床意義。進一步深入研究MCM2表達調控在乳腺癌發生發展的機制，可能找到預防和治療乳腺癌的方法。MCM2可能成為乳腺癌基因治療一個新的潛在分子靶點。

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