結直腸上皮內瘤變中LGR5的表達及其意義

肖幼華 李 榮 蔡聯(lián)明 謝旭平 盧致洋 陳漢民 王冬梅 雷先華

結直腸上皮內瘤變是結直腸癌的癌前病變，是結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的一個病理階段，是一個新的病理診斷名詞，各級醫(yī)院均已普遍使用這一診斷名詞，其病變限于黏膜上皮或只侵犯固有膜而沒有通過黏膜肌層到黏膜下層，無轉移的危險。治療方法主要是局部手術治療。有文獻報道，術前50%～90%的結直腸上皮內瘤變，術后被證實為結直腸癌，而結直腸癌，則需要采用根治性手術。本研究通過檢測結直腸上皮內瘤，腺瘤及腺癌LGR5蛋白表達水平可將上皮內瘤變與腺癌區(qū)別開來，從而選擇正確的外科治療方法。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集贛州市腫瘤醫(yī)院2011年-2012年住院及門診病例，其中結直腸上皮內瘤變60例(腺瘤合并高級別上皮內瘤變32例，腺瘤合并低級別上皮內瘤變28例)其中有3例合并腺癌，男性46例，女性24例，年齡29～79歲，隨機選取腺瘤10例，男性6例，女性4例，年齡37～69歲，均取自電切或手術切除標本。高分化腺癌20例，男性11例，女性9例，年齡30～70歲，均取自同期手術切除標本。各組臨床病理資料經統(tǒng)計學檢驗無差異。

1.2 主要試劑

兔腸上皮干細胞蛋白單克隆抗體Anti- LGR5及SP-0023免疫試劑盒，均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 方法

厚4 μm 的石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精再水化。置CBS(pH6.0)高壓熱修復20 min，自然冷卻，PBS沖洗3 次，每次3 min。加LGR5 一抗，37 ℃溫箱孵育1 h。PBS 沖洗3 次，滴加二抗，37 ℃水浴箱孵育20 min，PBS 沖洗3 次。DAB 顯色，蘇木精復染，封片，在顯微鏡下觀察攝片。用PBS 代替一抗作為陰性對照，用經反復驗證的已知陽性切片作為陽性對照。

1.4 結果判斷

LGR5以胞質呈棕黃色為陽性染色。高倍鏡下(× 200)每張切片隨機選擇5 個視野，每個視野計數(shù)200 個腫瘤細胞，共1 000 個，計算陽性腫瘤細胞所占的百分數(shù)。腫瘤細胞無著色為(-)； 陽性細胞數(shù)< 25% 為(+)； 25%～50%為(++)；> 50%為(+++)。所有切片均由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法做出判斷。

1.5 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.5統(tǒng)計分析軟件包對數(shù)據(jù)進行分析。免疫組化檢測數(shù)據(jù)行Fisher精確檢驗，Pearson Chi-square檢驗。以P<0.05為差異，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組織中LGR5表達情況

LGR5 免疫組化陽性產物主要分布于細胞質中，呈棕黃色細顆粒狀，細胞核和細胞膜幾乎不著色。結直腸腺瘤中LGR5陽性表達率為40.00%(4/10)，上皮內瘤變中其陽性表達率為83.33%(50/60)，腺癌為100.00%(20/20)，見表1。

表1 結直腸上皮內瘤變、腺瘤、腺癌中LGR5表達情況/例

2.2 LGR5表達與結直腸上皮內瘤變病理分級的關系

LGR5在高級別上皮內瘤變組和低級別上皮內瘤變組中陽性表達率分別為84.37%(27/32)、82.14%(23/28)，結果表明LGR5表達水平與結直腸上皮內瘤變病理分級無相關性(表2)。

表2 LGR5表達與結直腸上皮內瘤變病理分級的關系/例

3 討論

LGR5(rich in leucine repeated units of G protein coupled receptor 5)屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族，可在胃腸道、毛囊等多種組織表達。新近研究表明LGR5是Wnt通路的目標基因，與R-脊蛋白結合能夠增強Wnt/B-catenin信號，進而促進結直腸癌的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)LGR5表達陽性的干細胞是結直腸癌的起始細胞，作為潛在的結直腸干細胞標志物的LGR5在結直腸癌中大量表達[1-2]。結直腸癌發(fā)生的病理過程，是從腺瘤—上皮內瘤變—腺癌的過程，結直腸上皮內瘤變作為結直腸癌的癌前病變，是腺瘤轉變?yōu)橄侔┑囊粋€重要環(huán)節(jié)。檢測LGR5在結直腸癌不同病理階段的表達，有助于結直腸癌的早期診斷[3]。

有資料表明LGR5可促進結直腸腺瘤的發(fā)生，從而促進腺瘤向上皮內瘤變，腺癌的轉變[4-5]。Becker等[6]運用免疫組織化學的方法比較正常結腸、癌前病變以及結腸腺瘤LGR5的表達發(fā)現(xiàn)，正常的組織中LGR5在隱窩基底部表達，而在癌前病變的組織中LGR5的表達并不局限于隱窩基底部且表達量較高，結腸腺瘤中LGR5較少在基底部表達，而是在腺腔的表面大量表達.此研究表明LGR5是人腸道干細胞的一個潛在標志物，其失巢表達是干細胞向癌前病變轉變的早期事件，并在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。本研究中，在腺瘤，上皮內瘤變，腺癌當中均能檢出LGR5，說明腺瘤，上皮內瘤變，腺癌的發(fā)生均來源于結直腸干細胞。

本研究還發(fā)現(xiàn)LGR5在腺瘤，上皮內瘤變，腺癌中的表達水平不一致。腺瘤表現(xiàn)為陰性和陽性，在上皮內瘤變表現(xiàn)陽性和中陽性，在腺癌中表現(xiàn)為中陽性和強陽性，有統(tǒng)計學意義。本研究中有3例上皮內瘤變標本取自距腺癌4～10 cm，均表現(xiàn)為中陽性，且腺癌組織表現(xiàn)為中陽性，兩者完全吻合，說明這3例標本也已癌變。

有資料表明，術前50%～90%的結直腸上皮內瘤變，術后被證實為結直腸癌[7]。利用LGR5在腺瘤，上

皮內瘤變，腺癌中的表達水平不一致這一特點，我們可以用于上皮內瘤變的鑒別診斷，是上皮內瘤變，還時腺癌，為外科醫(yī)生選擇手術方式提供依據(jù)。本研究中10例LGR5表達陰性及30例表達陽性者，均為上皮內瘤，手術采取電切術，局部切除術。18例表達中陽性者，有9例是腺癌，50%的中陽性患者需行根治性手術，還有50%的中陽性患者則需腸段切除術。許多研究表明LGR5在癌組織及癌旁組織大量表達[1]，對于結直腸上皮內瘤變中LGR5表達中陽性者，就給予腸段切除或根治性手術。高級別上皮內瘤變中，1例表達為強陽性者，經局部切除后，術后病理診斷為腺癌，而行二次手術。低級別上皮內瘤變中，1例表達強陽性者，術前為腺瘤，行局部切除，術后為低級別上皮內瘤變，術后8個月，轉變?yōu)橹蹦c癌，而行Miles手術。

綜上所述，對于術前病理診斷為結直腸上皮內瘤變，加做LGR5檢測，根據(jù)LGR5表達水平不同，可以鑒別是瘤變，還是腺癌，LGR5是鑒別結直腸上皮內瘤的良好的免疫組化指標，為選外科手術方式提供重要的參考依據(jù)，避免了行二次腸鏡，二次病理活檢，二次手術。

[1] 陳小燕，趙 逵.LGR5與結腸癌關系的研究進展〔J〕.世界華人消化雜志，2013，21(8)：673-678.

[2] Takahashi H，Ishii H，Nishida N，et al.Significance of LG-R5(+ve)cancer stem cells in the colonand rectum〔J〕.Ann Surg Oncol，2011，18(4)：1166-1174.

[3] 郝艷平，胡順明，張世棟，等.干細胞標記物LGR5在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的表達及意義〔J〕.山東大學學報(醫(yī)學版)，2009，47(8)：85-88.

[4] Takeda K，Kinoshita I，Shimizu Y，et al.Expression of L-GR5，an intestinal stem cellmarker during stage of colorectal tumorgenesis〔J〕.Anticancer Res，2011，31(1)：263-270.

[5] Al-Kharusi MR，Smartt HJ，Greenhough A，et al.LGR5 promotes survival in human colorectal adenoma cells and is upregulated by PGE2：implications for targeting adenoma stem cells with NSAIDs〔J〕.Carcinogeesis，2013，34(5)：1150-1157.

[6] Becker L，Huang Q，Mashimo H.Immunostaining of LGR5，an intestinal stem cell marker，in normal and premalignant human gastrointestinal tissue〔J〕.Scientific World Journal，2008，8：1168-1176.

[7] 肖幼華，蔡聯(lián)明，李 榮，等.結直腸上皮內瘤變18例臨床分析〔J〕.實用癌癥雜志，2012，27(6)：622-623，626.