纖維連接蛋白表達與骨肉瘤肺轉移的相關性研究

周 琰 張 星 陸志剛 姚 陽

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是源于間葉組織以能產生骨樣組織的梭形基質細胞為特征的惡性腫瘤，占原發性骨惡性腫瘤的首位[1]。OS好發于青少年，惡性度高，進展迅速，常早期發生血行或淋巴結轉移，預后差。隨著新輔助化療等的應用，患者5年生存率有所提高，已從上個世紀70年代的10%～15%提高到目前的50%～70%[2-3]。影響骨肉瘤轉歸最主要的原因是其轉移率極高，而肺是最常見器官，一旦發生轉移患者的5年生存率顯著降低不足20%。近年許多學者著重研究與骨肉瘤預后相關的分子途徑，本研究關注了細胞外基質的重要組分——纖維連結蛋白(fibronectin,FN)。FN最初是在培養的雞胚成纖維細胞上發現的1種纖維細胞表面抗原，主要作用是介導細胞與細胞、細胞與基質粘連結合，促進細胞分化、定向遷移。FN在骨肉瘤組織中的表達及其與預后的相關性的相關研究較少。本研究旨在探討FN表達與骨肉瘤肺轉移的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集自2010年1月至2012年1月上海市第六人民醫院收治的、經病理活檢確診為初發骨肉瘤病例36例，均為保肢術后接受了一線大劑量密集MTX、ADM+DDP、IFO方案交替化療12個療程，化療結束后門診隨訪2年，肺轉移18例，男性11例，女性7例，中位年齡14.6歲。無肺轉移18例，男性10例，女性8例，中位年齡13.3歲。

1.2 主要試劑

兔抗人FN多克隆抗體，SP免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術公司。

1.3 免疫組織化學檢測法

石蠟標本制成4 μm厚切片，常規二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸入3%H2O2溶液中，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，3 min×3次。0.01M枸椽酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)微波爐加熱至95 ℃左右，放入切片加熱10～15 min，進行抗原修復，滴加試劑A一正常山羊血清工作液，室溫孵育15 min，傾去血清，勿洗。滴加1∶50稀釋的兔抗人多克隆抗體FN一抗(福州邁新公司)，4 ℃冰箱孵育過夜。次日取出PBS沖洗，3 min×3次。滴加試劑B一生物素標記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育15 min。PBS沖洗，3 min×3次。滴加試劑C一辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min。PBS沖洗，滴加新鮮配置的DAB溶液，在顯微鏡下控制顯色。背景染色出現前終止染色，蒸餾水沖洗，蘇木精復染2 min，蒸餾水充分洗滌。用已知陽性組織切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果分析

FN陽性為腫瘤細胞胞質和(或)細胞膜出現棕黃色染色。參考過氧化物酶染色評分標準，對陽性細胞數量及染色強度進行評分。評分標準為：1分為陽性顆粒所占細胞面積為1/2以下；2分為陽性顆粒所占細胞面積為1/2～2/3；3分為陽性顆粒所占細胞面積為4/5，但顆粒邊界清晰；4分為陽性顆粒所占細胞面積為4/5以上，且顆粒聚集分界不清。統計500個細胞中陽性細胞數及陽性積分。

1.5 統計學方法

應用SPSS 13.0軟件對相關數據進行統計處理。兩樣本均數比較采用成組設計t檢驗。

2 結果

2.1 骨肉瘤組織中FN表達的相關性分析

肺轉移骨肉瘤組織中FN表達陽性率明顯高于非肺轉移組，且多呈彌漫性棕黃色顆粒，評分多在3分以上；而非肺轉移骨肉瘤組織中其陽性細胞百分比明顯下降，且陽性棕黃色顆粒多占細胞面積的2/3以下，評分多在1～2分，兩組比較差異有顯著性(P<0.01)，見表1。

表1 FN在肺轉移和非肺轉移骨肉瘤組織中表達的差異

*為與非肺轉移組比較，P<0.05。

2.2 FN表達與骨肉瘤臨床病理特征的相關性

非肺轉移組中FN表達陽性率及積分與骨肉瘤腫瘤大小、腫瘤分期相關，而與腫瘤組織學分級無關，見表2。肺轉移組FN表達僅與其淋巴結轉移顯著相關，見表3。

表2 非肺轉移組FN表達與其臨床病理特征的相關性分析

*為組間對比有統計學差異，P<0.05。

表3 肺轉移組FN表達與其臨床病理特征的相關性分析

*為組間對比有統計學差異，P<0.05。

3 討論

骨肉瘤占惡性腫瘤的0.2%，約75%的骨肉瘤患者年齡為15 ～ 25歲,男性多于女性(1.5∶1),年齡< 6歲或> 60歲的患者罕見。骨肉瘤通常起源于長骨的干骺端,股骨、脛骨和肱骨占大約80%，原發于骨干的腫瘤罕見，而末端骨腫瘤如手和足的腫瘤少于1%，我國每年約有6 000～7 000例新病例。由于骨肉瘤好發于骨增長時期，起病時無典型臨床癥狀，極易與外傷或生長痛混淆，而其惡性程度高，早期極有可能發生肺轉移。近30年來，骨肉瘤的治療有了較大的突破，但就診早期出現肺轉移的患者，5年生存率仍低于20%，早期鑒定可能發生肺轉移的預測指標，對骨肉瘤生存率的提高具有重大的臨床意義。

FN 是1種含有巖藻糖和氮基乙糖的細胞外非膠原糖蛋白，腫瘤組織中FN質與量的變化與瘤細胞的粘附、轉移有密切的關系。Bae等[4]檢測了1 596例浸潤性導管癌的乳腺癌患者組織標本發現，FN表達與淋巴結轉移，腫瘤分級，Her-2表達正相關，與無病生存率及總生存率負相關，是激素陽性浸潤性導管癌患者獨立預后因素。Knowles等[5-6]的研究顯示，血漿纖維連接蛋白通過形成微小血凝塊，促進腫瘤細胞的侵襲，增加黑色素瘤肺轉移。同時FN通過上調Tie2，保護腫瘤細胞免受炎癥介質的細胞毒作用。有學者[7]分析了胃腸道及其他頭頸部腫瘤患者血漿FN水平，發現腫瘤患者血漿FN水平遠高于正常對照。Pal等[8]在FN預包被的培養板上培養前列腺癌細胞PC3可顯著提高細胞金屬機制蛋白酶MMP9和MMP1的表達，使細胞遷移能力顯著提高。Steffens等[9]檢測腎癌組織FN表達，發現有轉移患者原發灶FN陽性率為無轉移患者原發灶的4倍，轉移灶中FN陽性率則是無轉移病灶的7倍，回顧性分析發現病灶FN表達程度與患者5年生存率呈負相關。這個現象在卵巢癌也同樣被證實，分化不良和有淋巴結轉移的復發卵巢癌病例FN表達率高于無轉移的卵巢癌組織[10]。FN表達水平對骨肉瘤預后有何指導作用呢？本研究顯示在肺轉移組骨肉瘤組織中FN蛋白呈彌漫高表達率(>80%)，遠高于非肺轉移組，差異顯著，提示FN高表達對遠處有一定預示意義。進一步分析發現，在非肺轉移組FN表達組化陽性率及積分與骨肉瘤腫瘤大小、分期相關，與組織學分級無關，但在肺轉移組FN表達僅與其淋巴結轉移顯著相關。該結果同樣驗證了FN表達與淋巴結轉移相關的趨勢，但由于標本量較少，尚不能完全確定腫塊大小及分期與FN表達的相關性。

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