蛹蟲草固態發酵轉化西洋參中人參皂苷的研究1)

逄世峰，閆梅霞，孫成賀，王英平

(中國農業科學院特產研究所，長春130112)

蛹蟲草(CordycpsmilitarisLink) 又名北冬蟲夏草，屬真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，是冬蟲夏草的近緣種[1]，是我國歷史上十分名貴的珍稀、營養、滋補、保健及藥用真菌[2-3]。

西洋參在我國有悠久的藥用歷史,具補虛,安神降壓,益氣生津,祛痰解熱之功效[4]，現代藥理學研究證實人參皂苷是其發揮藥理作用的主要活性成分，其中以人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量最高[5]。

微生物發酵是利用微生物細胞產生的一種或多種酶將外源底物進行催化使其轉變成結構相關的經濟價值更高的產物[6]。本文首次利用蛹蟲草固態發酵西洋參，研究蛹蟲草固態發酵對西洋參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd的轉化作用,為藥用植物產品開發提供一種新途徑。

1 儀器、試劑和材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(waters公司)；電子分析天平(sartorius CPA225D 型)。

1.2 試劑

乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 材料

蛹蟲草(CordycepsmilitarisLink)；西洋參(PanaxquinquefoliumL.)須為干燥須根；人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd(購自中國藥品生物制品檢定所)。

2 方法與結果

2.1 培養基配制

復合PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，MgSO42g，K2HPO41.5g，KH2PO41.5g，瓊脂18g，水1000mL。

液體菌種培養基(PDB)：不加瓊脂的復合PDA培養基配方。

固體發酵培養基：取5年生干燥西洋參須，截為長度3～5cm，選用100mL三角瓶，每瓶裝入5g西洋參須，料水比為1g∶2mL，121℃滅菌20min。

2.2 菌種復壯和液體菌種制作

試管種平板復壯：將4℃保存的試管種進行平板復壯(22℃，暗培養)，復壯培養基為復合PDA培養基。

液體菌種制作：用復壯后菌種制作液體菌種，培養基為液體菌種培養基(PDB)，選用250mL三角瓶，裝液量為130mL/瓶，接種3塊經打孔器打孔的平板菌種，搖床培養，180r/min，22℃暗培養7d。

2.3 固體發酵接種與培養

固體培養基每瓶接種4mL液體菌種，置于23℃黑暗培養，分別于第0、1、2、3、4、6、8、11、14、17、20、23、26、28、31、34、37d取樣。

2.4 人參皂苷含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd對照品1.00、1.22、1.00、0.97、1.74、1.02、1.54mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇適量使其溶解，稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4.2 色譜條件[7]

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1×50 mm，1.7 μm)，流動相乙腈-水(梯度洗脫：0～3min，19%～19%乙腈；3～4min，19%～21%乙腈；4～5min，21%～26%乙腈；5～9min，26%～27%；9～12min，27%～32%乙腈；12～15min，32%～43%乙腈)，流速0.5 mL/min，檢測波長為203 nm，柱溫35℃，進樣量2 μL。

圖1 標準品和樣品UPLC色譜圖

2.4.3 標準曲線的繪制

取人參皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rb3、Rc、Rd標準品溶液，加甲醇制成一系列濃度的混合標準品溶液，在上述色譜條件下，注入超高效液相色譜儀。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程如下：

Rg1:Y=9.86×105X-1.68×103(R2=0.9993)

Re:Y=1.21×106X +1.57×103(R2=0.9997)

Rg1:Y=6.56×105X-2.11×103(R2=0.9991)

Rc: Y=5.76×105X-1.83×103(R2=0.9996)

Rb2:Y=5.97×105X-2.79×103(R2=0.9996)

Rb3:Y=7.54×105X-1.46×103(R2=0.9990)

Rd:Y=6.61×105X +4.87×103(R2=0.9984)

2.4.4 樣品含量測定

每個樣品加入50mL甲醇靜置提取3天，取上清液過0.22μm微孔濾膜后超高效液相色譜儀測定。在上述色譜條件下測定人參皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量，結果見圖2。

圖2 蛹蟲草固態發酵西洋參皂苷含量變化

由圖2可知，在蛹蟲草固態發酵西洋參基質過程中，本實驗測定的7種人參皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rb3、Rc、Rd含量均有不同程度的變化。總體來看，人參皂苷Rg1、Re、Rg1、Rb2、Rc、Rd在接菌后的24h內含量明顯降低，Rb3含量升高；Rg1在第1～3天含量先升后降，4～20天含量逐漸降低，20～31天含量變化不大，31～37天含量降低；Rd含量1～26天逐漸升高，26～37天含量降低。

3 討論

隨培養時間延長，本實驗測定的7種人參皂苷出現不同程度的變化，其中以人參皂苷Rg1和Rd變化最為明顯，第26天人參皂苷Rd含量最高，與第0天相比較，Rd含量增加290.69%，Rg1轉化率為84.59%，且Rg1減少量與Rd增加量相當，推斷在酶的作用下，人參皂苷Rg1向Rd轉化[8]。培養后期，菌絲長滿基質后，各人參皂苷含量均有不同程度的降低，可見皂苷含量與菌絲生長狀況密不可分。

總之，蛹蟲草菌種所產生的酶系對人參皂苷具有轉化作用，且專一性較好，此方法為人參皂苷Rd的大量制備提供了一種新資源，同時也為功能產品開發及新藥生產提供了一種新途徑。

[1]胡昭庚.17種藥用真菌栽培[M].北京:中國農業出版社,1999.

[2]李昊,吳白昌,李春蘭.蟲草人工栽培與深度開發[M].北京: 科學技術文獻出版社,2003:3-5.

[3]張平,朱述鈞,錢大順,等.北冬蟲夏草功能成分及保健作用分析[J].江蘇農業科學,2003(6): 105-107.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業出版社,2010:122.

[5]孟祥穎,任躍英,李向高,等.西洋參中皂苷類成分的研究綜述[J].特產研究,2001(3):43-46.

[6]孫亮,張美萍,王義,等.人參皂苷生物轉化及固體發酵工藝研究進展[J].食品工業科技,2013,32(15):395-399.

[7]張翠英,董,梁,陳士林，等.人參藥材皂苷類成分UPLC特征圖譜的質量評價方法[J].藥學學報,2010,45 (10):1296-1300.

[8]Li Ye,Chao-Qun Zhou,Wei Zhou,et al.Biotransformation of ginsenoside Rg1to ginsenoside Rd by highly substrate-tolerant Paecilomyces bainier 229-7[J].Bioresource Technology,2010,101: 7872-7876.