槲皮素聯合白藜蘆醇逆轉白血病細胞株HL-60-ADM耐藥性的影響

張復華* 尹松梅* 牛國敏 楊國雷 凌奕文 李 蕊 徐嘉愉

（1 南方醫科大學附屬南海醫院，廣東 佛山 528200；2 中山大學附屬孫逸仙紀念醫院，廣東 廣州 510120）

急性白血病是血液系統最常見的惡性疾病，聯合化療是治療急性白血病的主要手段，但仍有部分患者不能緩解或緩解后很快復發[1]。白血病細胞對化療藥物產生多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是化療失敗的主要原因，尋找高效低毒的白血病耐藥逆轉藥物是目前研究的重點[2]。槲皮素是自然界分布最廣泛的黃酮類化合物，本研究前期發現槲皮素（Quercetin，Que）通過抑制Cox-2的表達降低Bcl-2的表達，同時誘導Bax的表達，啟動Caspase-3級聯反應誘導HL-60細胞凋亡[3]。研究提示槲皮素是有效的腫瘤MDR逆轉劑，可通過多種機制發揮逆轉腫瘤耐藥的作用。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是從葡萄植物屬中提取的多酚類化合物，有抑制腫瘤細胞生長及促凋亡等作用。本研究將Que、Res兩種低毒性的植物提取物用于急性髓系白血病耐藥細胞株HL-60-A的研究，觀察藥物單用、聯合對腫瘤細胞的生長抑制及逆轉耐藥等影響，探討Que及Res逆轉白血病細胞耐藥的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料：槲皮素（sigma，美國），白藜蘆醇（sigma，美國）用DMSO溶解，阿霉素（adriamycin，ADM）（深圳萬樂公司，中國）用生理鹽水溶解，制成母液后-20 ℃保存。

1.2 細胞培養：HL-60、HL-60-A細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所，HL-60-A為ADM誘導HL-60細胞株建立的耐藥細胞株，本實驗室冷凍保存。復蘇細胞接種于含10%胎牛血清（杭州四季青 中國）、3%谷氨酰胺的RPMI 1640完全培養基，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，每2～3 d傳代換液一次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 CCK-8法檢測Que、Res的細胞毒性作用：取對數生長期HL-60、HL-60-A細胞，計數并接種于96孔板，每孔接種細胞5×104個。不同濃度Que、Res單用或聯用（濃度梯度設為0、12.5、25、50、75、100、150μmol/L）加入細胞中，每個濃度設3個平行孔，設空白孔，陰性對照組，每孔液體終體積200μL，培養48 h后加入37 ℃預熱的CCK-8(同仁化學研究所，日本)，在培養箱中繼續孵育4 h后在酶標儀上檢測，以空白孔調零，檢測波長為450 nm，參照波長為630 nm，測定各孔吸光度值，記錄結果，取3個復孔的平均吸光度值作為該濃度條件下的OD值。實驗重復3次，取平均值。細胞存活率（%）=（處理組OD值/對照組OD值）×100%。以藥物濃度對數為橫軸，抑制率為縱軸繪制濃度-效應曲線，根據線性回歸方程求出半數抑制率（IC50）。

1.4 CCK-8法檢測Que、Res單用或聯用對耐藥細胞的逆轉作用：取對數生長期HL-60-A細胞接種于96孔板中，分別加入Que、Res與不同濃度ADM（濃度梯度為0 2.5 5 10μg/mL）孵育，實驗分組如下：①對照組；②Que 12.5 μmol/L+ADM；③Res 12.5μmol/L+ADM；④Que 6.25μmol/L+ Res 6.25 μmol/L+ADM；⑤Que 25μmol/L+ADM；⑥Res 25μmol/L+ADM；⑦Que 12.5μmol/L+ Res 12.5μmol/L+ADM，余實驗步驟同實驗方法1.3。耐藥指數（Resistance index，RI）=IC50（耐藥細胞）/IC50（親本細胞）；逆轉倍數（Reversal fold，RF）=IC50（逆轉前）/IC50（逆轉后）。

1.5 統計方法：數據描述使用均數±標準差，兩獨立樣本均數的比較用t檢驗；多組資料間均數的比較用方差分析。數據應用SPSS19.0軟件處理。

2 結果

2.1 ADM對HL-60-A細胞耐藥性的分析

不同濃度的ADM（濃度梯度為 0.025、0.05、0.1、0.2、1.25、2.5、5、10 μg/mL）與HL-60及HL-60-A共培養48h檢測對ADM的耐受性，結果顯示，ADM對HL-60及HL-60-A的IC50值分別為（0.042±0.002）、（5.124±0.004）μg/mL，RI為122，提示HL-60-A細胞為耐藥細胞株。

2.2 Que、Res單用及聯用對HL-60-A細胞毒性的影響

不同濃度的Que、Res分別與HL-60-A共培養48 h檢測細胞存活率，Que、Res對HL-60-A的IC50值分別為（74.74±9.27）、（100.57±4.66）μmol/L，提示單獨使用Que、Res均可抑制HL-60-A生長，其細胞毒性作用呈劑量依賴性；Que+Res 對HL-60-A的IC50為（54.84±6.29）μmol/L，提示聯合使用Que+Res可進一步殺傷白血病細胞（圖1）。

圖1

2.3 Que、Res單用及聯用對HL-60-A細胞耐藥性的影響

根據Que、Res對HL-60-A細胞毒性作用可見，Que、Res濃度為12.5及25μmol/L時毒性弱，選用此2種濃度作為逆轉耐藥濃度分別與ADM孵育。方差分析結果顯示，Que 12.5μmol/L、Res 12.5μmol/L、Que 6.25μmol/L+Res 6.25 μmol/L與不同濃度ADM孵育后細胞存活率差別有意義（P＜0.05），Que 25μmol/L、Res 25μmol/L、Que 12.5μmol/L+Res 12.5 μmol/L組間差別亦有意義（P＜0.05）；Que、Res單獨使用12.5 μmol/L時ADM的IC50值分別（3.59±0.04）、（3.97±0.02）μg/mL；RF為 1.54倍和1.40倍；劑量25μmol/L時IC50值分別（2.45±0.02）、（3.63±0.01）μg/mL，RF為 2.26倍和1.52倍，提示小劑量Que或Res即可增強ADM對HL-60-A的殺傷作用，Que增敏作用更明顯；Que、Res聯合使用時IC50值分別（2.98±0.02）、（1.97±0.01）μg/mL，RF為 1.86倍和2.81倍，較Que、Res單用RF明顯下降，表明聯合使用Que、Res可進一步逆轉HL-60-A耐藥的作用。

3 討論

作為黃酮類化合物中最常見及應用范圍最廣的Que目前認為其有抗氧化、抗過敏、抗血栓、抗血小板聚集和神經保護等多種生物活性及藥理作用，且對白血病在內的多種惡性腫瘤細胞有生長抑制作用，逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥可能是其發揮抗腫瘤作用的重要機制之一[4,5]。本研究發現Que不僅可以殺傷白血病細胞，對白血病耐藥細胞亦有一定的殺傷作用，低劑量時即可以明顯增強ADM對HL-60-A的敏感性，與蔡迅等[6]研究結果大致一致。本結果同時提示Que是低毒性物質，單用對HL-60-A的殺傷及逆轉耐藥效果均有限，可通過聯用低毒性藥物增強其抗腫瘤作用。Res作為葡萄屬提取物是一種安全的藥物，亦有一定的抗腫瘤作用[7]，本研究用其聯合Que進一步研究抗腫瘤作用。結果發現，Res有一定的抗白血病作用，但較Que弱。低劑量Que+Res（6.25或12.5μmol/L）對HL-60-A的RF明顯比單用Que或Res（12.5或25μmol/L）高，提示聯合使用Que和Res可提高逆轉白血病細胞耐藥性，其作用機制可能與其加強抑制細胞膜上MRP泵功能，減少耐藥細胞內化療藥物外流有關[8]，本研究將進一步研究其作用機制，為Que、Res應用于臨床提供依據。

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[8]Shen J,Zhang W,Wu J.The synergistic reversal effect of multidrug resistance by quercetin and hyperthermia in doxorubicin-resistant human myelogenous leukemia cells[J].Int J Hyperthermia,2008,24(2):151-159.