血漿和支氣管肺泡灌洗液中脂連素和TXB2、6-keto-PGF1α水平與急性肺損傷關系的研究

孫玉花，李來傳，史有奎，臧全玲，陳京霞，李 鳳，張秀文

（1.濰坊醫學院，山東 濰坊261031；2.濰坊醫學附屬醫院急診科，山東 濰坊261031）

急性肺損傷是一種常見危重急癥，每年的發病率一直穩步上升。據最新統計數據我國每年大約有1 200 000人患病，且醫院病死率約40%～60%［1］。ALI的發病機制復雜，多數學者認為可能與炎癥細胞（中性粒細胞、肺泡巨噬細胞等）被激活以及內皮細胞受損而導致大量炎性介質及細胞因子生成和釋放有關。脂連素（APN）是近年來發現的主要由脂肪細胞分泌的一種蛋白質激素，盡管APN最初被描述為胰島素增敏劑，最近的研究已定義有多效性抗炎和血管保護作用［2，3］，且早有國外文獻報道低脂連素血癥可增加ALI發生的風險。此外，在小鼠的實驗研究表明，APN有助于肺的免疫穩態［4］。根據APN的免疫和血管保護特性，其理論上可能用于治療ALI。國內對于APN是否參與ALI發生發展過程的研究尚少，本研究通過測定正常對照組和ALI組大鼠的血漿和支氣管肺泡灌洗液（BALF）在不同觀察時期的APN水平的變化情況，觀察其與ALI的關系，并對APN水平與ALI的程度是否存在相關性進行研究。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SD大鼠共45只，購于濰坊醫學院動物實驗中心，飼養于干凈、適溫的實驗室，正常飲食，并避免發生肺部感染。

1.1.2 實驗藥品

LPS：E.coli內毒素；氟烷；1%戊巴比妥。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理：將45只大鼠隨機分成生理鹽水對照組（9只）與實驗組（36只）。用氟烷將大鼠麻醉并固定于操作臺。用簡易霧化器給予實驗組氣管內霧化吸入LPS 0.5m L／kg（用生理鹽水配制LPS200μg／m L），對照組氣管內霧化吸入生理鹽水0.5m L／kg。然后將處理后的36只實驗組動物再隨機分成4組，每組9只進行觀測，LPS給予后觀察4h為4h組，觀察12h為12h組，觀察24h為24h組，觀察48h為48h組。對照組觀察24h。

1.2.2 觀察實驗動物和采集標本：在大鼠觀察完畢時，給予各大鼠50mg／kg的1%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉。然后，暴露氣管并開胸，觀察肺形態。采集心臟血后，在左心耳開一約2mm切口，右室插入套管針，并于右室灌注肝素生理鹽水沖洗肺血管床直至肺組織潔白。將左主支氣管結扎后取左下肺組織（約1cm×1cm×0.5cm）用4%多聚甲醛浸泡固定24h，常規脫水、包埋、制成蠟塊后用HE染色，用于光鏡下觀察。余下的左肺組織稱濕重（W）后置60℃溫箱，7d后稱干重（D），求得濕重／干重比（W／D）。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）留取及細胞計數：右肺用磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗8次，每次2.5m L，回收灌洗液。用單層紗布濾去黏液后取濾液10m L以3500rpm離心10min，吸取上清液保存于-20℃冰箱中待測細胞因子的含量及總蛋白的含量，離心后沉渣用于白細胞計數和中性粒細胞百分比的測定。

1.2.4 血漿和BALF中APN、TXB2、6-keto-PGF1α含量的測定：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附（ABC-ELISA）法分別檢測各樣本APN、TXB2、6-keto-PGF1α的含量水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統計分析，各組數據均以（）表示。組間差異采用單因素方差分析，SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異顯著。相關性分析采用直線相關回歸分析。

2 結果

2.1 大鼠的體征指標

在觀察時間內所有大鼠均存活。各組大鼠呼吸頻率的差異無統計學意義。肺濕／干重表明，4～12h組與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），24～48h組與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 BALF細胞計數、分類及白蛋白含量

LPS給予后4～48h的各實驗組BALF中性粒細胞數及白蛋白含量與對照組相比均有統計學差異（P＜0.05）。見表1。

表1 ALI大鼠不同時相濕／干重、BALF細胞總分數及白蛋白含量（，n=9）

表1 ALI大鼠不同時相濕／干重、BALF細胞總分數及白蛋白含量（，n=9）

注：符號相同組間無差異，P＞0.05；符號不同（＃、＊）組間有差異，P＜0.05。

組別 濕／干重 白蛋白（g／L） 細胞總數×106 巨噬細胞% 中性粒細胞% 淋巴細胞%.3 13.6±3.3 4h組 6.73±0.68＊ 0.53±0.16＊ 18.9±0.6＊ 6.3±1.2＊ 89.6±7.3＊ 4.1±1.4＊12h組 6.50±0.59＊ 0.59±0.15＊ 19.0±1.3＊ 6.8±3.2＊ 87.9±6.9＊ 5.6±2.5＊24h組 4.80±0.58 0.37±0.12＃ 17.8±1.4＊ 7.1±3.8＊ 88.3±10.7＊ 4.7±1.8＊48h組 4.70±0.75 0.31±0.05＃ 16.9±0.9 28.5±2.7＃ 64.2±8.2＃ 6.2±1.9對照組 4.48±0.37 0.15±0.03 14.1±1.2 79.2±4.2 7.3±2＃

2.3 肺組織病理改變

2.3.1 NS對照組：光鏡下肺泡結構完整，無紅細胞及中性粒細胞滲出（見圖1）。

圖1 對照組

2.3.2 4h組：大體觀察可見肺組織腫脹，包膜光亮，約半數可見出血點。光鏡（見圖2）肺泡腔內有明顯的中性粒細胞呈灶狀浸潤及紅細胞少量滲出；肺泡壁彌漫性輕度水腫、增厚且肺間質輕度水腫，紅細胞及淋巴細胞浸潤；還可見不規則形的毛細血管擴張。

圖2 4h組

2.3.3 12h組：大體與4 h組外觀相似，光鏡下（見圖3）較4h組肺泡腔內紅細胞滲出明顯，纖維蛋白滲出幾乎充滿管腔，中性粒細胞大面積滲出，肺泡間隔明顯增寬。

圖3 12h組

2.3.4 24～48h組：大體觀察可見肺組織略發黃，但無出血點。光鏡（見圖4）見肺泡腔內有泡質碎片，中性粒細胞浸潤減少；肺泡腔擴大且肺泡壁薄厚不均；肺泡間質及成纖維細胞增生并有淋巴細胞、巨噬細胞浸潤。毛細血管擴張少見，形態不規則。

圖4 24～48h組

2.4 血漿和BALF中APN和TXB2、6-keto-PGF1α水平的變化

實驗組中4h、12h組血漿和BALF中APN、6-keto-PGF1α水平低于正常對照組，且血漿中APN差異更顯著（P＜0.01）；4h、12h組血漿和BALF中TXB2水平高于正常對照組 （P＜0.05）；24h、48h組中APN、TXB2及6-keto-PGF1α水平與對照組無差異（P＞0.05）。見表2。

表2 ALI大鼠不同時相血漿和BALF中APN和TXB2、6-keto-PGF1α含量及肺損傷評分（，n=9）

表2 ALI大鼠不同時相血漿和BALF中APN和TXB2、6-keto-PGF1α含量及肺損傷評分（，n=9）

注：符號相同組間無差異，P＞0.05；符號不同（＾、＊）組間有差異，P＜0.05，＃ 組與對照組相比差異顯著，P＜0.01。

組別 肺損傷評分Serm APN（ng／m L） TXB2（ng／L）6-keto-PGF1α（ng／L）BALF APN（ng／m L） TXB2（ng／L）6-keto-PGF1α（ng／L）對照組 0.8±0.8 16.9±2.0 127.6±48.5 94.2±18.9 1.7±0.1 131.7±36.5 99.2±16.2 4h組 8.4±1.8 9.5±1.9＊＃ 187.7±61.2＊ 82.4±15.4 1.5±0.2 216.6±45.1＊＃ 88.8±14.6 12h組 11.6±1.9 8.3±1.2＊＃ 259.1±32.6＊＃ 80.9±10.3 1.4±0.2＊ 338.5±33.2＊＃ 85.7±10.2 24h組 3.9±2.0 15.1±1.8＾ 143.4±62.1＾ 85.1±11.9 1.5±0.3 147.3±49.2 90.1±11.9 48h組 4.9±2.4 15.2±1.2＾ 139.3±38.2＾88.4±14.8 1.6±0.3 145.3±21.5 93.4±14.5

2.5 相關性分析

BALF中APN水平與ALI評分不存在直接相關性，血漿中APN水平與ALI評分存在較高的負相關（r=0.936，r2=0.877，P＜0.01）。

3 討論

ALI的發生發展機制非常復雜，目前認為ALI是多種炎癥介質相互作用的結果，且細胞因子之間相互聯系、相互影響形成復雜的促炎介質及抗炎介質系統，兩大炎癥系統的相互作用形成更為復雜的“細胞因子網絡”，當打破兩大系統之間的平衡，則發生炎癥介質失控性釋放，導致ALI甚至多器官功能障礙綜合征。

ALI時，創傷、感染等因素刺激血循環中出現高水平的β-腎上腺能激動劑、LPS、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，β-腎上腺能激動劑可抑制脂肪細胞中APN的mRNA水平且LPS、TNF-α能直接抑制脂肪細胞中APN mRNA的表達等，均可抑制APN分泌。APN分泌減少可通過降低細胞（內皮細胞）內腺苷酸環化酶的含量水平［5，6］影響游離脂肪酸的代謝導致血管內皮功能障礙、內皮細胞的損傷以及通過激活AMPK途徑從而抑制 NF-k B途徑的激活［7］的作用減弱，均可導致中性粒細胞聚集，造成各種炎癥介質的大量釋放，其中血小板和白細胞釋放的血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）可強烈收縮血管、支氣管平滑肌和誘導血小板聚集，引起血管、支氣管痙攣和血管內廣泛的微血栓形成，造成微循環障礙、組織缺氧壞死等病理性損害；此外，APN濃度降低引起內皮細胞的損傷導致PGI2的表達減少，當TXA2升高、PGI2降低，打破兩者濃度平衡時，可引發血管收縮、血小板聚集及血栓形成等從而加重ALI。本實驗通過測定ALI不同時相的血漿APN濃度，得出4h、12h組的APN濃度與對照組相比明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；血漿中TXB2的濃度與對照組相比明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.05），6-keto-PGF1α較對照組在相應時相表現出與APN濃度降低程度相一致的低表達濃度，李金玲等［8］所做的油酸致家兔急性肺損傷的結果與本結果一致。ALI時循環中APN水平的下降引起TXB2水平升高，具有拮抗它作用的6-keto-PGF1α的水平降低，TXB2／6-keto-PGF1α比例失衡，促炎反應與代償性的抗炎反應平衡被破壞，造成對機體的損害。此實驗結果與Jason M Konter［9］等所證實的低脂連素血癥可增加急性肺損傷的風險這一理論相符合。ALI時肺作為主要的靶器官，肺泡毛細血管膜和肺泡上皮損害，肺毛細血管通透性增加，富含蛋白質的體液積聚于肺間質和肺泡內，導致肺水腫。早有 Miller M等［10］研究發現：氣道內皮細胞也可分泌APN及表達APN功能性R1受體。雖然目前的研究主要集中在APN通過保護內皮細胞減弱LPS誘導的ALI，APN也可能通過其他非細胞機制介導抗炎作用。之前有國外報告APN已被證明在體外可結合LPS［11］。但是如果這個機制發揮了重大的作用，BALF中細胞因子水平的下降應該已經出現在4h后，這與本實驗中4h組的BALF中TXB2水平升高相矛盾，且本研究中BALF中的APN濃度的水平變化對照組相比無統計學意義，我們可推測APN的非細胞抗炎作用并不是ALI調制作用的主要機制。此假設與Jason M Konter所研究的APN通過抑制內皮細胞活化減弱LPS誘導的急性肺損傷的實驗調查結果相一致。本研究同時記錄了大鼠的肺損傷評分，血漿中APN水平與肺損傷評分結果呈較高的負相關（r=0.936，r2=0.877，P＜0.01）。BALF中APN含量則無相關性，進一步說明血漿APN水平能夠反應肺損傷的程度。ALI的炎癥反應過程是逐漸發展變化的，本研究利用小劑量LPS建立了輕型ALI模型［12］，以利于研究ALI的發生、發展甚至修復等一系列病理過程，可動態觀察各個指標的變化，將有益于深入探討APN在其中的作用。

綜上所述，本研究表明APN參與了ALI的發生發展過程，且血漿APN水平可反映ALI程度。

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