乙酰水楊酸（阿司匹林）體外對流感病毒H1N1的抑制作用

丁 寧，盧 芯，鄭叢龍，韋淳巍，許夢亭，向 敏，林雨馨

（大連大學 醫學院，遼寧 大連 116622）

0 引言

流感病毒（influenza virus）是單負鏈RNA病毒，屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的一種。通常分為人類和動物流感病毒兩大類。其中人類流感病毒據其病毒核蛋白的抗原性可分為三類：A（甲），B（乙），C（丙）。由于流感病毒是以呼吸道傳播為主，預防困難，曾多次造成了全球范圍的大流行[1,2]。據統計平均每一年因感染流感病毒直接造成15000人死亡，另一方面因流感間接致死的也高達500000人。迄今為止全球范圍內還沒有特異的流感防治藥物。雖然目前普遍認為可緩解病人的發病率及死亡率的措施是接種流感疫苗，但由于流感病毒變異迅速的特性，針對其有效的疫苗研制將需要幾個月，所以易感人群不能及時得到接種。另一方面現在臨床常用于治療流感的藥物主要是奧司他韋（達菲）、金剛烷胺、扎那米韋等，但目前使用均發現這些藥物存在不同程度的耐藥現象[2]。所以近年來基礎及臨床研究者都在積極尋找針對流感防治的有效藥物和方法，是微生物研究領域重中之重。

乙酰水楊酸（Acetylsalicylic Acid）俗名阿司匹林（AS），又稱醋柳酸,是分子量 180.16白色針狀或板狀結晶或結晶性粉末。無臭，微帶酸味。在干燥空氣中穩定，遇潮則緩慢水解成水楊酸和醋酸。為臨床常用解熱鎮痛藥，藥理作用主要為：消炎、解熱、止痛及抗風濕作用，其本身還有對血小板凝集的抑制作用[3]。本文主要討論阿司匹林在體外對流感病毒H1N1的抑制作用及其作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和病毒株

細胞株：人肺癌細胞（A549），由大連市疾控中心惠贈，傳代培養液氮保存。

病毒株：H1N1流感病毒，血凝效價(1:512)。中科院武漢市病毒所惠贈，雞胚接種傳代液氮保存。

1.1.2 主要試劑

乙酰水楊酸（AS）：Sigma產品；RPMI1640：含有10%的胎牛血清；RPMI1640維持液：含2%的小牛血清；神經氨酸酶活性檢測試劑盒：江蘇碧云天。

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養箱：美國NUAIR，型號NU-5500E；超凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司，型號BCN-1360B；倒置顯微鏡：日本 OLYMPUS，型號CKX44。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅細胞凝集（HA)試驗檢測AS對H1N1的血凝效價影響

將等體積的0.5 mg/mL、2 mg/mL、10 mg/mL AS溶液與H1N1病毒液分別作用90 min，檢測各組病毒血凝效價。用于檢測AS對H1N1引起的紅細胞凝集是否有抑制作用。

1.2.2 AS對H1N1神經氨酸酶活性抑制作用

按照神經氨酸酶試劑盒操作要求，于室溫條件下1 mg/mL及5 mg/mL的AS分別作用于H1N1病毒60min（同時設陽性和陰性對照組），加熒光酶作用底物混勻后，37℃孵育20 min。設立發射波長和激發波長為460 nm和355nm，測定熒光值后計算病毒對神經氨酸酶活性的抑制率。

1.2.3 雞胚接種法測定AS對H1N1病毒的抑制作用

1.5 mL EP管中分別將流感病毒液(效價為1:512)與等體積蒸餾水、AS溶劑及AS溶液（10 mg/mL）充分混合室溫作用2 h。分別取100 μL上述三種病毒混合液注射至雞胚尿囊腔中，嚴格遵守無菌操作。37℃溫箱孵育72 h后取出雞胚，置于4℃冰箱過夜，次日采集雞胚尿囊液，測定各個濃度AS對流感病毒的殺傷作用。

2 結果

2.1 紅細胞凝集試驗測AS對H1N1血凝效價的影響

如圖1所示，病毒與0.5 mg/mL、2 mg/mL、10 mg/mLAS分別相互作用后的血凝效價分別為1:512、1:256、1:64和低于 1：2。結果表明，AS對 H1N1表面的血凝素活性具有抑制作用，且作用比較顯著。

圖1 HA凝集抑制實驗檢測AS對H1N1的血凝效價的影響

2.2 AS對病毒H1N1神經氨酸酶活性的抑制作用

如圖2所示，AS作用濃度為1 mg/mL時作用60 min后對 H1N1病毒神經氨酸酶活性的抑制率大于40%，5 mg/mL的AS作用60 min后神經氨酸酶活性的抑制率大于 80%，而病毒組的抑制率小于 20%，AS組與病毒對照組差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明，AS阻斷病毒對細胞的感染的機制是通過抑制H1N1包膜上的神經氨酸酶活性來實現的。

圖2 AS對H1N1病毒神經氨酸酶活性的抑制作用

2.3 雞胚接種試驗檢測AS對流感病毒的滅活作用

如圖3所示，AS作用流感病毒H1N1后感染雞胚，收集尿囊液，血凝試驗檢測其病毒液效價均小于1:2，檢測溶劑對照組和病毒組效價均為1:512。實驗結果表明，AS在體外濃度為10 mg/mL能有效抑制病毒增值。

圖3 雞胚培養法檢測AS對流感病毒H1N1的滅活作用

3 討論

本實驗結果提示，流感病毒在AS作用下，血凝素對紅細胞的凝集能力以及神經氨酸酶的活性都有明顯的抑制作用。AS體外抗流感病毒作用的一個重要的機制可能是AS對流感病毒中這兩種蛋白質的直接作用。目前研究認為流感病毒感染宿主細胞時流感病毒H1N1血凝素和神經氨酸酶起到關鍵作用，對這兩種蛋白功能產生的抑制，將有效阻止其感染宿主細胞。另一方面雞胚接種實驗則表明，乙酰水楊酸在濃度為10 mg/mL時對流感病毒H1N1有直接殺滅的作用。

對于加強臨床流感病毒感染預防工作而言，本實驗中發現AS對流感病毒具有直接殺滅作用具有重要意義[4]。AS在臨床各科室常用于消炎、解熱、止痛、抗風濕及抗凝，局部使用無明顯毒副作用（過敏反應除外）；尤其近年研究顯示其對于消化道腫瘤、艾滋病毒均有一定抑制作用，使得人們對其藥物作用機理的研究引發起新的熱潮。查閱文獻表明，其使用濃度均高于本研究中乙酰水楊酸對流感病毒作用的劑量[2,5]。因此，本課題組將應用分子生物學等手段進一步深入研究AS對病毒直接滅活的作用機制。

[1]Fedso DS. Vaccine development for an imminent pandemic:why we should worry, what we must do [J]. Hum Vaccine,2006, 2(1): 38-42.

[2]Alan WH. Vaccines for pandemic influenza: The history of our current vaccines, their limitations and the requirements to deal with a pandemic threat [J]. Ann Acad Med Singapore,2008, 37(6): 510-517.

[3]張曉冬. 阿司匹林的藥理特性及其臨床應用[J]. 黑龍江科技信息, 2011(04): 30.

[4]林雨馨, 王兆雪, 楊喆東, 等. N-乙酰半胱氨酸體外對流感病毒H1N1的抑制作用[J]. 中國微生態學雜志, 2014(02):112-117.

[5]湯玲珍. 阿司匹林在H2O2誘導的人黑素細胞氧化應激損傷中的作用及機制研究[D]. 第四軍醫大學, 2012.