可溶性嚙齒目動物CD59功能多肽的制備及生物活性鑒定

尤濤++董洲++張可可

摘 要：構建含嚙齒目動物小鼠的CD59a功能片段及6×His鍵的質粒載體，將其轉染入原核生物表達體系BL21大腸桿菌，擴增，裂解細菌，層析柱純化，得到CD59a功能多肽，并運用SDS-PAGE鑒定其分子量，經典及替代途徑溶血實驗鑒定其生物活性。結果表明：利用基因工程的方法在原核BL21大腸桿菌表達體系中可制備有良好的抑制補體溶血活性的小鼠CD59a功能多肽，其分子量約18.4KDa，為嚙齒目動物CD59的功能研究以及進一步的動物實驗奠定了基礎。

關鍵詞：CD59；原核生物表達體系；生物工程

中圖分類號 Q78 文獻標識碼A文章編號1007-7731（2014）13-23-03

CD59是一種以糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨著于細胞膜表面的補體抑制蛋白，廣泛分布于動物多種組織細胞表面，并能以游離形式存在于尿液、唾液、淚液等多種體液中。CD59在補體系統激活后的酶級聯反應的終末，阻礙C8與C9分子的結合，抑制補體終末反應物MAC（C5b－C9n復合物）的形成，從而保護細胞免受MAC導致的細胞裂解效應［1-2］。故CD59與動物的免疫系統密切相關，可抵御病原微生物激活補體對動物組織細胞的殺傷作用，是動物自體免疫調節的重要膜蛋白。獲得具有良好生物活性的CD59功能多肽，有助于對CD59功能的進一步研究。筆者嘗試應用組織工程技術，利用原核的大腸桿菌BL21表達體系制備重組嚙齒目動物小鼠的CD59a功能部位多肽，并應用溶血實驗鑒定其生物學活性，為嚙齒目動物CD59的功能研究以及進行進一步的動物實驗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 BL21大腸桿菌，由中國科技大學大分子結構與功能實驗室提供；Pat28a質粒（其圖譜見圖1）：his鍵連接位點為Ndel，購自美國novagen公司。

1.1.2 主要試劑 IPTG （isopropyl beta-D-thiogalactoside，I prepared at 1 M），美國invitrogen 公司；BugBuster Master Mix 細胞裂解液，美國novagen公司；cocktail 蛋白酶，美國novagen公司；SDS-PAGEmarker，美國TEDIA公司；His－Bind 純化Kit，美國Novagen 公司。

1.1.3 主要儀器 -80℃深低溫冰箱，美國Farma Scientific公司，Eppendorf5414臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；Eppendorf5810R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；紫外分光光度計UVC-515型，美國ULTRA-LUM公司；恒溫細菌培養搖床，美國lab-line instruments公司；垂直電泳儀，美國Bio-Rad公司；Vortex-Genie 2多功能旋渦混合器，美國Scientific Industries；U-Tube?蛋白收集器，美國novagen公司。

圖1 Pat28a質粒圖譜

1.2 方法

1.2.1 小鼠CD59功能多肽質粒載體的構建 根據genebank及Uniport得到小鼠CD59a功能部的基因序列。CD59a功能部-6his序列：共228bp GAATTCCTCACAT GCTACCACTGTTTCCAACCGGTGGTTTCTTCATGCAATATGAACAGCACTTGCTCTCCTGACCAGGATTCCTGTCTCTATGCTGTAGCCGGAATGCAAGTGTATCAAAGGTGTTGGAAACAATCAGATTGTCATGGTGAGATCATTATGGACCAATTAGAAGAGACAAAATTAAAATTCAGATGCTGCCAGTTTAACTTGTGTAACTAGCTCGAG。

引物設計為：上游引物—5′GGAATTCCATATGCTCACATGCTACCAC；

下游引物—5′CCGCTCGAGTTAGTTACACAAGTTAAAC。

應用分子克隆技術構建小鼠CD59功能多肽的Pat28a質粒載體。

1.2.2 小鼠CD59a功能多肽的表達、純化 取感受態BL21細胞100μL，加入質粒5μL，混勻混合物，在冰上放置20min，再放入42℃的水浴中90s，然后在冰上冷卻1～2min。加入LB培養基800μL，置于37℃搖床（100～150r/min），震蕩45min。200μL菌液鋪于氨芐青霉素的瓊脂平板表面。37℃培養溫箱內培養24h。表達：第一天：挑取單克隆接種于5μLB（100μg/mL氨芐青霉素）培養液的培養瓶中，225r/min，37℃培養高密度細菌一夜；第二天：過夜菌5μL加入1 000mL LB培養液的大瓶中，37℃搖床上搖晃小于2h，分光儀檢測OD600值（0.8～1.0）。當OD600值在0.8～1.0時，加入IPTG，1∶1 000稀釋，在搖床上搖晃24h，225r/min。取出細菌培養液在4℃離心機中5 000r/min，約6min，保存沉淀在-20℃冰箱。在菌沉淀中加入ddH20超聲波碎菌20min，16 000r/min離心，取上清。純化第四天：過濾后的上清加到層析柱中，分別加入Binding buffer、Elute Buffer及Strip buffer洗脫下來在4℃冷室內或冰上收集洗脫液，即是純化出的小鼠CD59a功能多肽。

1.2.3 小鼠CD59功能多肽的濃縮 蛋白多肽樣品加NaCl補加到0.3M NaCl。超濾管插入冰上預冷，在附有5KD膜中加入樣品500μL，將內管套入外管，14 520r/min離心30min后，將內管倒置套入另一個干凈離心管中3 880r/min離心收集濃縮后蛋白樣品。樣品放入自動控制凍干機中，真空冷凍干燥。

1.2.4 蛋白質變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定重組CD59多肽及純度 先行制備12%5mL分離膠及5%2mL濃縮膠。按1∶1體積加入提取的蛋白多肽液10μL和凝膠上樣緩沖液10μL。同時取同蛋白質marker和凝膠上樣緩沖液混合。在100℃加熱3min變性，加樣后將電泳。卸下玻璃板剝膠，把膠浸泡在5倍體積的染色劑中，緩慢平搖脫色4～8h。將膠取出放在白熾燈下拍照（見圖2）。

1.2.5 溶血實驗

1.2.5.1 經典途徑 準備紅細胞：正常健康小鼠抗凝血，離心機3min，4 000r/min。每管吸取紅細胞沉淀14μL，再加入1 000μLPBS清洗2次，最后一次由GVB++清洗一次。加入GVB++900μL后分管。羊抗小鼠RBCIgG抗體2μL。GVB++稀釋到50μL。不同劑量的CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血漿96孔板的每個孔中加入100μL的紅細胞懸液，然后加入不同稀釋濃度的CD59功能多肽。再加入50μL稀釋過的羊抗小鼠的單克隆抗體。輕輕混合后，放入37℃水浴箱內，溫浴30min，真空離心機離心后，每孔吸取150μL的液體放入新的96孔板中，讀OD411nm值陽性對照組（完全溶解組）：100μL的紅細胞懸液中加入100μL的雙蒸水，然后如上讀取OD411nm值。陰性對照組（無溶解組）：100μL的紅細胞懸液加100μLGVB++，然后如上讀取OD411nm值。計算紅細胞的溶解率：溶解率（%）=（實驗組OD411nm-陰性對照組OD411nm）/（陽性對照組411nm-陰性對照組OD411nm）×100。

1.2.5.2 替代途徑 如上法準備紅細胞，原始蛇毒素溶液是1μg/μL，加20μL蛇毒素到4μL GVB++，形成5μg/μL蛇毒素。不同劑量的重組CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血漿。96孔板的每個孔中加入100μL的紅細胞懸液，然后加入50μl的（蛇毒素CVF）到每管，再加入50μL的不同稀釋濃度的重組CD59功能多肽。輕輕的混合后，在37℃水浴箱內，溫浴30min，真空離心機離心后，每孔吸取150μL的液體放入新的96孔板中，讀OD411nm值。參照上述方法建立陽性對照組及陰性對照組并計算紅細胞的溶解率。

2 結果與分析

2.1 可溶性CD59功能多肽的制備 本次試驗成功制備了CD59的功能多肽，分子量大小約18.4KDa，純度較高，見圖2。圖2中，右邊泳道是蛋白質marker，左邊泳道是小鼠CD59功能多肽。

圖2 小鼠CD59功能多肽

2.2 生物學活性鑒定 制備的小鼠CD59功能多肽有效抑制了抗體激活的溶血反應（經典途徑及替代途徑），可見隨著功能多肽濃度的增加，對補體激活的溶血反應抑制性越強，表現出良好的生物學活性（見圖3）。

圖3 小鼠CD59功能多肽抑制溶血反應實驗結果

3 討論

CD59與人類及動物的多種疾病密切相關，最早人們發現CD59的功能缺陷導致了人類陣發性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）的產生，CD59缺乏的小鼠表現出明顯的溶血傾向［3］。近期科學家又發現CD59缺乏的小鼠中MAC在關節中大量沉積，損傷關節軟骨細胞，加速了退變性關節炎的產生，扮演了中心性角色［4］。CD59還與T細胞的信號傳導密切相關，調節T細胞的活化［5］，在動物免疫系統中扮演了重要的角色。獲得良好結構和功能的CD59蛋白，有助于對其功能研究工作開展進一步開展。但CD59蛋白具有明顯的種屬特異性，嚙齒目動物CD59基因存在2組序列CD59a及CD59b［6］，CD59a分布廣泛，存在各種組織器官中，而CD59b主要存在于嚙齒目動物的生殖系統。故針對嚙齒目動物CD59a功能的研究較為廣泛。

CD59是細胞膜表面結合蛋白，其通過GPI共價結合于細胞膜的磷脂雙分子層，研究表明GPI結構在CD59的功能發揮中起重要作用，但現有的基因工程、蛋白純化的手段獲得大量GPI-錨固蛋白極其困難，目前尚無簡單有效、經濟可行的技術來實現。原核細胞表達體系具有蛋白質表達量大，表達穩定，條件要求不高及可操作性強等優點，可大量制備蛋白多肽應用于動物實驗，有利于對蛋白質功能的進一步研究。本實驗應用大腸桿菌原核表達體系成功提取了具有較高純度的嚙齒目動物小鼠的CD59a的功能部多肽，其不包括與細胞膜結合的GPI結構，但包含抑制C8與C9結合，形成MAC結構的功能部；溶血實驗證實其可有效的抑制經典及替代途徑補體激活的細胞殺傷效應，可見此CD59a功能多肽有良好的補體抑制功效，利用它可進行相關CD59功能的實驗研究，是一個非常有意義的探索。但CD59功能多肽與GPI結構良好的天然CD59蛋白生物活性可能仍存在一定的差異，需進一步的實驗研究證實；同時利用基因工程技術獲得大量具備良好GPI結構的CD59蛋白值得進一步的探討。

參考文獻

［1］Markiewski MM，Lambris JD.The role of complement in inflammatory diseases from behind the scenes into the spotlight［J］.Am J Pathol，2007，171（3）：715-27.

［2］Huang Y，Qiao F，Abagyan R.Defining the CD59-C9 binding interaction［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，（37）：27 398-27 404.

［3］Qin X，Hu W，Song W，et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（4）：221-227.

［4］Wang Q，Rozelle AL，Lepus CM，et al.Identification of a central role for complement in osteoarthritis［J］.Nat Med，2011，17：1 674-1 679.

［5］高美華，秦云，王冰，等.CD59在T細胞LAT脂筏內移位及跨膜信號轉導中的作用［J］.免疫學雜志，2013，29（4）：301-305.

［6］Qin X，Hu W，Song W，et al.Generation and phenotyping of mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（2）：65-70.

（責編：張宏民）

1.2.5.2 替代途徑 如上法準備紅細胞，原始蛇毒素溶液是1μg/μL，加20μL蛇毒素到4μL GVB++，形成5μg/μL蛇毒素。不同劑量的重組CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血漿。96孔板的每個孔中加入100μL的紅細胞懸液，然后加入50μl的（蛇毒素CVF）到每管，再加入50μL的不同稀釋濃度的重組CD59功能多肽。輕輕的混合后，在37℃水浴箱內，溫浴30min，真空離心機離心后，每孔吸取150μL的液體放入新的96孔板中，讀OD411nm值。參照上述方法建立陽性對照組及陰性對照組并計算紅細胞的溶解率。

2 結果與分析

2.1 可溶性CD59功能多肽的制備 本次試驗成功制備了CD59的功能多肽，分子量大小約18.4KDa，純度較高，見圖2。圖2中，右邊泳道是蛋白質marker，左邊泳道是小鼠CD59功能多肽。

圖2 小鼠CD59功能多肽

2.2 生物學活性鑒定 制備的小鼠CD59功能多肽有效抑制了抗體激活的溶血反應（經典途徑及替代途徑），可見隨著功能多肽濃度的增加，對補體激活的溶血反應抑制性越強，表現出良好的生物學活性（見圖3）。

圖3 小鼠CD59功能多肽抑制溶血反應實驗結果

3 討論

CD59與人類及動物的多種疾病密切相關，最早人們發現CD59的功能缺陷導致了人類陣發性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）的產生，CD59缺乏的小鼠表現出明顯的溶血傾向［3］。近期科學家又發現CD59缺乏的小鼠中MAC在關節中大量沉積，損傷關節軟骨細胞，加速了退變性關節炎的產生，扮演了中心性角色［4］。CD59還與T細胞的信號傳導密切相關，調節T細胞的活化［5］，在動物免疫系統中扮演了重要的角色。獲得良好結構和功能的CD59蛋白，有助于對其功能研究工作開展進一步開展。但CD59蛋白具有明顯的種屬特異性，嚙齒目動物CD59基因存在2組序列CD59a及CD59b［6］，CD59a分布廣泛，存在各種組織器官中，而CD59b主要存在于嚙齒目動物的生殖系統。故針對嚙齒目動物CD59a功能的研究較為廣泛。

CD59是細胞膜表面結合蛋白，其通過GPI共價結合于細胞膜的磷脂雙分子層，研究表明GPI結構在CD59的功能發揮中起重要作用，但現有的基因工程、蛋白純化的手段獲得大量GPI-錨固蛋白極其困難，目前尚無簡單有效、經濟可行的技術來實現。原核細胞表達體系具有蛋白質表達量大，表達穩定，條件要求不高及可操作性強等優點，可大量制備蛋白多肽應用于動物實驗，有利于對蛋白質功能的進一步研究。本實驗應用大腸桿菌原核表達體系成功提取了具有較高純度的嚙齒目動物小鼠的CD59a的功能部多肽，其不包括與細胞膜結合的GPI結構，但包含抑制C8與C9結合，形成MAC結構的功能部；溶血實驗證實其可有效的抑制經典及替代途徑補體激活的細胞殺傷效應，可見此CD59a功能多肽有良好的補體抑制功效，利用它可進行相關CD59功能的實驗研究，是一個非常有意義的探索。但CD59功能多肽與GPI結構良好的天然CD59蛋白生物活性可能仍存在一定的差異，需進一步的實驗研究證實；同時利用基因工程技術獲得大量具備良好GPI結構的CD59蛋白值得進一步的探討。

參考文獻

［1］Markiewski MM，Lambris JD.The role of complement in inflammatory diseases from behind the scenes into the spotlight［J］.Am J Pathol，2007，171（3）：715-27.

［2］Huang Y，Qiao F，Abagyan R.Defining the CD59-C9 binding interaction［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，（37）：27 398-27 404.

［3］Qin X，Hu W，Song W，et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（4）：221-227.

［4］Wang Q，Rozelle AL，Lepus CM，et al.Identification of a central role for complement in osteoarthritis［J］.Nat Med，2011，17：1 674-1 679.

［5］高美華，秦云，王冰，等.CD59在T細胞LAT脂筏內移位及跨膜信號轉導中的作用［J］.免疫學雜志，2013，29（4）：301-305.

［6］Qin X，Hu W，Song W，et al.Generation and phenotyping of mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（2）：65-70.

（責編：張宏民）

1.2.5.2 替代途徑 如上法準備紅細胞，原始蛇毒素溶液是1μg/μL，加20μL蛇毒素到4μL GVB++，形成5μg/μL蛇毒素。不同劑量的重組CD59功能多肽，加入50μL的正常小鼠血漿。96孔板的每個孔中加入100μL的紅細胞懸液，然后加入50μl的（蛇毒素CVF）到每管，再加入50μL的不同稀釋濃度的重組CD59功能多肽。輕輕的混合后，在37℃水浴箱內，溫浴30min，真空離心機離心后，每孔吸取150μL的液體放入新的96孔板中，讀OD411nm值。參照上述方法建立陽性對照組及陰性對照組并計算紅細胞的溶解率。

2 結果與分析

2.1 可溶性CD59功能多肽的制備 本次試驗成功制備了CD59的功能多肽，分子量大小約18.4KDa，純度較高，見圖2。圖2中，右邊泳道是蛋白質marker，左邊泳道是小鼠CD59功能多肽。

圖2 小鼠CD59功能多肽

2.2 生物學活性鑒定 制備的小鼠CD59功能多肽有效抑制了抗體激活的溶血反應（經典途徑及替代途徑），可見隨著功能多肽濃度的增加，對補體激活的溶血反應抑制性越強，表現出良好的生物學活性（見圖3）。

圖3 小鼠CD59功能多肽抑制溶血反應實驗結果

3 討論

CD59與人類及動物的多種疾病密切相關，最早人們發現CD59的功能缺陷導致了人類陣發性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）的產生，CD59缺乏的小鼠表現出明顯的溶血傾向［3］。近期科學家又發現CD59缺乏的小鼠中MAC在關節中大量沉積，損傷關節軟骨細胞，加速了退變性關節炎的產生，扮演了中心性角色［4］。CD59還與T細胞的信號傳導密切相關，調節T細胞的活化［5］，在動物免疫系統中扮演了重要的角色。獲得良好結構和功能的CD59蛋白，有助于對其功能研究工作開展進一步開展。但CD59蛋白具有明顯的種屬特異性，嚙齒目動物CD59基因存在2組序列CD59a及CD59b［6］，CD59a分布廣泛，存在各種組織器官中，而CD59b主要存在于嚙齒目動物的生殖系統。故針對嚙齒目動物CD59a功能的研究較為廣泛。

CD59是細胞膜表面結合蛋白，其通過GPI共價結合于細胞膜的磷脂雙分子層，研究表明GPI結構在CD59的功能發揮中起重要作用，但現有的基因工程、蛋白純化的手段獲得大量GPI-錨固蛋白極其困難，目前尚無簡單有效、經濟可行的技術來實現。原核細胞表達體系具有蛋白質表達量大，表達穩定，條件要求不高及可操作性強等優點，可大量制備蛋白多肽應用于動物實驗，有利于對蛋白質功能的進一步研究。本實驗應用大腸桿菌原核表達體系成功提取了具有較高純度的嚙齒目動物小鼠的CD59a的功能部多肽，其不包括與細胞膜結合的GPI結構，但包含抑制C8與C9結合，形成MAC結構的功能部；溶血實驗證實其可有效的抑制經典及替代途徑補體激活的細胞殺傷效應，可見此CD59a功能多肽有良好的補體抑制功效，利用它可進行相關CD59功能的實驗研究，是一個非常有意義的探索。但CD59功能多肽與GPI結構良好的天然CD59蛋白生物活性可能仍存在一定的差異，需進一步的實驗研究證實；同時利用基因工程技術獲得大量具備良好GPI結構的CD59蛋白值得進一步的探討。

參考文獻

［1］Markiewski MM，Lambris JD.The role of complement in inflammatory diseases from behind the scenes into the spotlight［J］.Am J Pathol，2007，171（3）：715-27.

［2］Huang Y，Qiao F，Abagyan R.Defining the CD59-C9 binding interaction［J］.Journal of Biological Chemistry，2006，（37）：27 398-27 404.

［3］Qin X，Hu W，Song W，et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（4）：221-227.

［4］Wang Q，Rozelle AL，Lepus CM，et al.Identification of a central role for complement in osteoarthritis［J］.Nat Med，2011，17：1 674-1 679.

［5］高美華，秦云，王冰，等.CD59在T細胞LAT脂筏內移位及跨膜信號轉導中的作用［J］.免疫學雜志，2013，29（4）：301-305.

［6］Qin X，Hu W，Song W，et al.Generation and phenotyping of mCd59a and mCd59b double-knockout mice［J］.Am J Hematol，2009，84（2）：65-70.

（責編：張宏民）