miR-503通過靶定IGF-1R基因抑制胃癌生長與侵襲

胡俊華，喻琴，楊艷果，王琦，盧光新

（1.湖北醫藥學院附屬人民醫院消化內科，十堰 442000；2.湖北醫藥學院附屬人民醫院兒科，十堰 442000）

胃癌（gastric carcinoma）是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率占消化道全部惡性腫瘤的首位。我國每年約有17萬人死于胃癌，幾乎為惡性腫瘤致死的全部患者的1/4。研究［1－4］表明，微小 RNA（miRNA）與胃癌的發生發展密切相關，多種miRNA在非惡性組織和胃癌組織中差異性表達。研究［5］發現，miR-503在胃癌細胞中可以抑制胃癌細胞的生長及細胞間質轉化，但是關于miR-503在胃癌中作用機制的研究尚不明確。本實驗利用實時定量PCR（Real-time PCR）證實了miR-503在胃癌中呈現低表達，可以抑制胃癌細胞生長，并且探索了miR-503對胃癌細胞生長和侵襲能力的影響機制及其發揮該作用的靶基因胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R），為胃癌的治療提供了新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 病理樣本 10例胃癌及癌旁組織樣本，由天津腫瘤醫院病理科提供，并已通過病理學驗證。

1.1.2 細胞 人胃癌細胞系 MGC-803和SGC－7901，購于上海中科院細胞庫。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清購自Hyclone公司；DMEM高糖培養基、1640細胞培養基及轉染用OPTI-MEM 均購自 Gibico公司；轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司（美國）；miR-503模擬物、模擬物對照、IGF-1R 干擾RNA、干擾RNA對照均購買于上海吉瑪技術制藥有限公司；反轉錄酶及Real-time PCR試劑盒購自Takara公司；體外細胞侵襲的Transwell小室購自Millipore公司；兔抗人IGF-1R、GAPDH（內參）多克隆抗體以及羊抗兔二抗購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人胃癌細胞系MGC-803使用90%DMEM高糖培養基＋10%胎牛血清培養；SGC-7901使用1640培養基＋10%胎牛血清培養。培養條件為37℃，5%CO2的細胞培養箱培養。

1.2.2 細胞轉染 在轉染前16～20h，將貼壁的細胞消化下來，鋪在6孔板中。調整細胞密度，使其接種時細胞匯合度達到70%～80%，然后按照Lipofectamine TM 2000說明書進行轉染。

1.2.3 RNA提取和Real-time PCR 用Trizol提取組織樣品中的總RNA，然后使用Nano-Drop分光光度儀器進行RNA濃度測定，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量。應用特異miR-503的反轉錄引物，同時用U6作為內參；對于大片段基因的檢測，用 Oligo（dT）作為通用引物，β-actin作為內參。Real-time PCR總反應體系20μL，其中包括cDNA和primer各1μL、SYBR熒光染料10μL、ddH2O 7 μL，反應程序為95℃，變性2min；95℃15s，60℃45s條件下40個循環。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達水平 將轉染48h處理后的細胞用PBS清洗，使用裂解液RIPA（50mM Tris-Cl pH 7.2，150mM NaCl，1%TritonX-100和0.1%SDS）裂解后提取蛋白，利用BCA方法測定蛋白濃度，最后用40μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳檢測。100V2h分離，橫流轉膜，5%脫脂奶室溫封閉2h后，IGF-1R一抗（1∶1 000）4℃搖床孵育過夜，TBST清洗后使用HRP標記的二抗（1∶10 000）室溫孵育2h，TBST清洗后應用化學發光法曝光顯影。

1.2.5 平板細胞克隆形成實驗 將轉染后的胃癌細胞按照200個細胞/孔的密度接種到12孔板，使單個細胞分散均勻，并放置于37℃，5%CO2的細胞培養箱內培養。每隔2d換液，當細胞形成肉眼可見（超過50個細胞）的克隆時，終止培養，然后用PBS清洗細胞，利用5%結晶紫進行染色并拍照計數。各細胞樣本接種3個復孔。

1.2.6 Transwell檢測細胞遷移能力 在轉染前16～20h，將貼壁的細胞消化下來，鋪在24孔板中。調整細胞密度，使其接種時細胞匯合度達到70%～80%，然后按照Lipofectamine TM 2000說明書進行轉染。轉染24h后，將細胞接種在Matrigel覆蓋的Transwell上層小室內（2×105細胞/孔），重懸在無血清培養基中，而小室底部是10%血清的培養基。待遷移24h后，將小室取出來，用甲醛和乙酸混合液固定15min，1×PBS清洗，用棉簽將小室內未穿過的細胞擦掉，結晶紫染色后用1×PBS沖洗。隨機性選擇3個視野進行拍照計數，計算平均每個視野下發生侵襲的細胞數目。

1.3 統計學方法

應用Excel 2010對數據進行統計學分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Real-time PCR檢測人胃癌及癌旁組織中miR-503及IGF-1RmRNA的表達情況

選取10例臨床胃癌及其癌旁組織樣本提取RNA，利用Real-time PCR檢測其 miR-503及IGF-1RmRNA的表達情況。miR-503在胃癌樣本中的表達量明顯低于癌旁組織的表達量（P＜0.01）；IGF-1RmRNA的表達情況正好相反，在胃癌樣本中的表達量明顯高于癌旁組織（P＜0.01）（見圖1A、圖1B）。

2.2 平板細胞克隆形成實驗檢測miR-503對胃癌細胞增殖的影響

用平板細胞克隆形成實驗檢測人胃癌細胞系MGC-803和SGC-7901的增殖能力，與對照組比較，轉染了 miR-503模擬物的 MGC-803和SGC－7901細胞的克隆數目均有明顯減少，差異具有統計學意義 （P＜0.05）（見圖2）。

2.3 Transwell小室實驗檢測miR-503對胃癌細胞侵襲能力的影響

用Transwell小室實驗檢測細胞的遷移能力，結果顯示，相較于對照組，轉染miR-503模擬物的MGC-803和SGC-7901的細胞穿透膜數目均明顯減少，差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）（見圖3）。

2.4 Western blot檢測miR-503對IGF-1R蛋白水平的影響

用IGF-1R一抗孵育，進行 Western blot實驗檢測miR-503對IGF-1R是否有影響。結果顯示，轉染miR-503模擬物的兩種胃癌細胞MGC-803和SGC-7901中IGF-1R的蛋白水平相比于對照組，均有明顯降低（見圖4）。

圖1 miR-503和IGF-1RmRNA在胃癌及癌旁組織中的表達情況

圖2 平板細胞克隆形成實驗檢測miR-503過表達對胃癌細胞增殖的影響

圖3 Transwell小室實驗檢測過表達miR-503對胃癌細胞侵襲的影響

圖4 Western blot檢測過表達miR－503對IGF-1R蛋白水平的影響

2.5 RNA干擾IGF-1R基因表達對胃癌細胞生長和侵襲的影響

利用 Western blot檢測IGF-1R的表達情況，相較于干擾RNA對照組，轉染了IGF-1R干擾RNA的胃癌細胞中IGF-1R的表達明顯降低。通過平板克隆形成實驗結果顯示，與對照組相比，轉染了的IGF-1R干擾RNA的細胞克隆數目均減少，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；通過Transwell小室實驗顯示，轉染IGF-1R干擾RNA的細胞穿透膜數目較對照組均明顯減少，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）（見圖5A、圖5B和圖5C）。

3 討論

MicroRNA是Lee等［6］于1993年在真核生物中發現的一類具有調控功能的內源性非編碼RNA，其大小約20～25個核苷酸，通過與目的mRNA序列中的部分堿基序列相互配對，從而調控部分編碼蛋白的基因表達，進而調控各種不同的生物進程。近年來研究［1－4］表明，miRNA與包括胃癌在內的多種癌癥的發生相關，且多種miRNA可定位于基因組上與癌癥相關的脆性位點，可見其在癌癥的發生過程中起著至關重要的作用。因此，miRNA越來越多地引起研究者關注，這也將使miRNA成為疾病診斷潛在的生物學標記，還可能使這一分子成為藥物靶標，或是模擬miRNA分子進行新藥物研發，可能會給人類疾病的治療提供一種新的手段。

越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤中起著原癌基因或抑癌基因的作用，與胃癌有著密切的關系。Chan等［7］通過研究發現，大部分胃癌患者中miR-21都在腫瘤中出現過度表達；Liu等［8］研究發現，miR-27a在胃腺癌中表現上調，抑制miR-27a將明顯抑制胃癌細胞的生長；Arisawa等［9］發現，miR-27a基因區域多態性可能是促進胃黏膜萎縮的重要因子。

最新研究［10，11］發現，miR-503在肝癌、肺癌中有明顯表達差異。此外，miR-503在胃癌細胞中低表達［5］。本實驗通過 Real-time PCR對10例胃癌組織和癌旁組織進行檢測，證實了miR-503在胃癌組織中確實呈現低表達。在 MGC-803和SGC-7901的兩種人胃細胞轉染miR-503模擬物，平板細胞克隆形成實驗結果表明，過表達miR-503可以明顯抑制胃癌細胞的增殖，同時Transwell實驗表明，過表達miR-503的胃癌細胞侵襲能力明顯減弱。兩種細胞的實驗結果一致，提示miR-503可能作為一種抑癌基因，參與抑制了腫瘤的生長和侵襲。

IGF-1R是IGF信號通路的關鍵蛋白，包括三陰性乳腺癌、胃癌［12，13］在內的多種惡性癌癥中均有高表達。大量流行病學以及臨床病理學的實驗結果顯示，由于胰島素樣生長因子1（IGF-1）的上調，IGF-1R在多種腫瘤細胞中均存在過量表達，其表達量和腫瘤發生率呈高度相關，因此，可以認為IGF-1R是具有良好開發前景的腫瘤治療靶點，尋找新的IGF-1R高選擇性的抑制劑則具有重要的臨床意義和應用前景。研究［14］表明，miR-503在神經膠質母細胞瘤中可以通過抑制IGF-1R的表達來發揮抑癌基因的作用。本研究通過Western blot的檢測結果顯示，過表達 miR-503的胃癌細胞 MGC-803和SGC-7901的IGF-1R蛋白水平均有明顯降低；且通過siRNA敲除人胃癌細胞系 MGC-803和SGC－7901中的IGF-1R后，平板克隆形成實驗和Transwell小室實驗結果顯示，敲除IGF-1R的表達后，細胞克隆形成能力和侵襲能力表現出相似的降低趨勢，進一步證實了miR-503通過靶定IGF-1R基因調控胃癌細胞的生長和侵襲，發揮著抑癌基因的作用。

圖5 RNA干擾IGF-1R基因表達對胃癌細胞生長和侵襲的影響

綜上所述，在人胃癌細胞中miR-503通過靶定IGF-1R基因進而調控胃癌細胞的生長和侵襲，發揮著抑癌基因的作用，該結果為探索治療胃癌的新分子標記物提供了新策略。

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