管材和流速對供水管道生物膜形成的影響

祝澤兵，吳晨光，鐘 丹，袁一星，單莉莉，張 杰，袁 媛

(1.哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.哈爾濱工業大學市政環境工程學院，150090哈爾濱)

供水管網系統是一個在貧營養條件下維持較高質量濃度余氯的極端環境體系，很多微生物仍然能夠存活于供水管網系統中［1］.由于管道內壁具有較大的比表面積，供水管網系統至少有95%的微生物附著在管道內壁生長.這些附著在管壁生物膜的微生物會威脅飲用水的水質安全.一方面在供水管網中貧營養條件下生長的微生物對余氯具有較高抵抗性，甚至在極高的余氯條件(10或25 mg/L)下，管壁生物膜的微生物仍然可以再生長并使氯衰減［2］;另一方面，生物膜在水力沖刷下會帶來感官學(如視覺、嗅覺、味覺等)和衛生學(如致病微生物)問題［3］.因此，對供水管網管壁生物膜形成、生長發育和控制的研究受到廣泛關注.

供水管網中諸多因素如水力條件、管材、消毒劑類型及濃度、水體中營養物質濃度等都會影響生物膜的形成和生長［4］.通常，經自來水廠處理合格的飲用水，由供水管網系統輸送至用戶龍頭時，管材和水力條件會隨著供水管網的延伸而發生明顯的變化［5］.無論管道材質如何，管道內壁都會形成生物膜［6］.同時，水力條件的變換對生物膜的累積和脫落具有重要作用，以往研究多集中在水力、水質條件對生物膜生物量形成的影響上［4，7］，而關于水力條件與管材因素對生物膜形成的交互影響的研究較少，有關管材和水力條件模擬試驗研究的報道還不多見.本文通過動態供水系統模擬試驗，研究了管材和流速對水質、管壁生物膜生物量形成和種群變化的影響，以期為供水管網管壁生物膜的控制奠定理論基礎，對于保證飲用水在供水管網系統中的安全輸送具有重要意義.

1 實驗

1.1 實驗裝置及方法

采用6套管道模擬系統并聯運行，共用一個高位水箱，模擬不同管材和流速的供水管道，管道模擬系統示意見圖1.其中高位水箱材質為304不銹鋼，容積為1.2 m3，低位水箱材質為PVC，容積為50 L，管段生物膜反應器為20段串聯的小管段，PE管段長10 cm，由外徑30 mm、壁厚3 mm的新管道加工而成.304不銹鋼管段長12.5 cm，由外徑25 mm、壁厚1 mm的新管段加工而成.高位水箱連接到低位水箱的干管為304不銹鋼管，其他輔助管道材料為PVC管，閥門為不銹鋼材質.實驗裝置組裝前，將新購置的PVC管和低位水箱用10 mg/L的NaClO溶液浸泡1個月，期間每3 d換一次水，以降低PVC材質對水質的影響.之后，將實驗新管段、PVC管和低位水箱先用洗液清洗一遍，再用70%(體積分數)乙醇浸潤沖洗一遍，用去離子水沖洗3遍，干燥待用［8］.實驗裝置組裝后，將自來水注入高位水箱，加入NaClO溶液攪拌使其余氯終質量濃度約為30 mg/L，開啟閥門1和水泵1，待30 mg/L余氯的自來水注滿低位水箱后關閉閥門1和水泵1，此時開啟閥門2、3、4和水泵2以一定流速閉路循環運行2 h，之后開啟閥門5將水排出.此后重復上述步驟通過開關閥門和水泵狀態注水、排水運行數次，以去除新管道模擬系統殘留的微生物和雜質.管道模擬系統前處理完畢后，自來水注入高位水箱，加入NaClO溶液(pH調至近中性)后攪拌穩定2 h.此后開啟閥門1、2、3、5 和水泵 1、2，以新配制水樣代替低位水箱和實驗管道舊水，避免引入空氣和擾動管道沉淀物，使水通過管道模擬系統直流排出，整個排出置換水過程持續約10 min;此后，先開啟閥門4，待自來水注滿低位水箱后關閉閥門1和水泵1，再關閉閥門5.通過調節閥門2、3、4使水樣分別以0.2，0.4和0.8 m/s的流速在管道內閉路循環流動12 h.此后保持水泵2的開啟和閥門2，3，4的開啟度，通過調節閥門1、5和水泵1開關狀態使管道模擬系統直流排出置換水和閉路循環流動交替運行直至實驗結束(生物膜取樣時除外).整個實驗期間通過調節高位水箱的加氯量保持低位水箱進水余氯約為1.0 mg/L，進水異養菌總數(HPC)約為5 CFU/mL，pH約為7.32，其他進水水質指標見表1.定期校準流速，實時調節閥門2，3，4的開啟度，以保證流速相對恒定.

圖1 管道模擬系統示意

1.2 生物膜取樣方法

在反應器運行至7，14，21，35，56，77，98 d時關閉泵2和閥門2，3，4，分別從6套管道模擬系統中各自小心豎直拆取(盡量確保其他未拆管段充滿水)2段管段進行異養菌(HPC)計數.每次采樣結束組裝好系統后，通過調節閥門和水泵狀態先直流排出置換水后再恢復至正常循環運行工況.反應器運行至119 d時，分別收集管道模擬系統中剩余6段管段內壁生物膜進行HPC測定和PCR-DGGE分析.將取下的管段用無菌小毛刷刷取管段內壁生物膜［7］，并將其懸浮于10～30 mL滅菌蒸餾水中.

1.3 生物膜和進出水HPC測定

將待計數的生物膜懸浮液置于超聲振蕩器中冰浴超聲振蕩1 min，間歇1 min，如此重復3次，再漩渦振蕩30 s，使生物膜細菌能夠均勻分布在懸浮液中，之后將懸浮液稀釋適宜質量濃度在R2A固體培養基上進行異養菌總數計數(HPC).對于主體水，用0.22 μm濾膜過濾10～100 mL的水樣，然后將濾膜截濾微生物的一面向上貼于R2A固體培養基上進行HPC計數.將處理好的R2A培養基平板放于20℃倒置恒溫培養10 d，即可獲得異養菌平板計數.

1.4 生物膜DNA提取和PCR-DGGE分析

將生物膜懸浮液用PowerSoilTMDNA Isolation Kit(MoBio Labaratories，Inc.，CA，USA)試劑盒提取生物膜上細菌總DNA.PCR及DGGE分析參照文獻［8］進行.PCR所用引物為真細菌通用引物，引物序列分別為 8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、518R(5’-ATTACCGCGGCTGCT GG-3’)，帶 GC 夾.測序結果與NCBI的 BlastX進行序列比對，并挑選相關序列用MEGA 5.2軟件構建系統發育樹.

1.5 其他水質測定方法

實驗中溫度、濁度、pH、電導率、TOC、總鐵等常規指標分析均按國家標準方法測定［9］，余氯的測定采用 DPD(N，N-二甲基-1，4-二苯胺)比色法.

1.6 數據處理方法

水質實驗結果表示為平均值±標準誤差，采用SPSS 13.0軟件對數據進行方差統計分析，用F檢驗判斷實驗組間是否存在顯著性差異，p＜0.05表示存在顯著性差異.

2 結果與討論

2.1 不同條件下進出水水質變化

不同運行條件的設置及其進出水水質變化和方差分析見表1，2.經過加氯后的進水水質較好，變化幅度小，運行期間進水細菌總數維持在1～15 CFU/mL，pH穩定在7.32左右.在模擬實際管道運行工況的實驗中，加氯水在各模擬裝置循環流動12 h后，水質均有不同程度變化.其中，以余氯、TOC變化最為顯著(p＜0.001)，其余水質變化均未達顯著水平.各模擬裝置進水余氯質量濃度為0.97 mg/L，12 h后衰減至0.20 mg/L左右;進水 TOC為 2.14 mg/L，12 h后增至 2.99～3.59 mg/L.管材對主體水中余氯、TOC均有顯著影響，而流速只對余氯的衰減影響顯著.本實驗中管道模擬系統輔助管道和低位水箱材質均為PVC，有研究表明，塑料管材(PVC、PE等)在輸送自來水時，會向水體中溶出可溶性有機碳(DOC)［10］，本實驗中 PVC 輔助材料大約釋放1 mg/L的TOC，不同裝置出水TOC均會有不同程度的升高，PE管道系統和不銹鋼管道系統PVC輔助材料的接觸面積基本相同，與不銹鋼管道系統相比，PE管材系統出水TOC增加更為顯著，PE管材釋放的TOC為0.39～0.54 mg/L，且PE管材的出水TOC質量濃度隨著流速的增大而增加，但未達顯著水平.初始氯質量濃度在0.97 mg/L時，經循環流動12 h后，各裝置的氯衰減率均達74%以上，與 Gibbs等［11］在1 mg/L余氯質量濃度下培養的PVC和鍍鋅鐵管道成熟生物膜的氯衰減率(0.72和0.86)相近.本實驗中PE管道生物膜對氯衰減率高于不銹鋼管道，并且流速也是影響PE管道中氯衰減的重要因素之一(p＜0.01)，因為PE管道本身會釋放部分消耗氯的有機物［10］，流速越快，釋放的有機物就越多，PE管道附著的生物膜數量也會高于不銹鋼.

表1 不同實驗條件下進出水水質變化

表2 不同實驗條件下出水水質方差分析(F檢驗)

圖2是不同運行條件下各管道模擬系統進出水細菌總數隨系統運行時間的變化.運行期間管材對出水細菌總數影響顯著 (p＜0.001，見表2).各裝置運行初期(前11 d)，出水細菌總數略低于進水細菌總數.隨著運行時間的增加，各裝置出水細菌總數逐步增加.首先是PE管中出水細菌總數快速增加，第53天后增速放緩，第81天后出水細菌總數基本維持在1 100～1 800 CFU/mL.流速對其影響不大(p＞0.5)，在0.4 m/s流速時出水細菌總數略高于0.2和0.8 m/s時.在前39 d不銹鋼管中出水細菌總數呈緩慢上升，之后進入快速上升狀態，第81天后增速放緩，第96天后出水細菌總數基本維持在480～580 CFU/mL.流速對不銹鋼管中出水細菌總數的影響與PE管相似.各裝置穩定運行后，出水細菌總數比進水增加25倍以上.進水經循環流動12 h的時間遠少于實際細菌增殖繼代的時間(1～17 d)，而且本實驗裝置是相對封閉的系統，沒有大量外源細菌的引入，因此，出水細菌總數主要來源于管壁生物膜上附著細菌的脫落［12］.

圖2 不同實驗裝置出水細菌總數隨時間變化

2.2 不同條件下生物膜上細菌總數變化

圖3為不同運行條件下各管道生物膜細菌總數隨系統運行時間的變化.整個運行期間，管材對生物膜上附著細菌總數的影響要大于流速對其的影響.不論何種水力條件，PE管道生物膜細菌總數均顯著大于同一時期的不銹鋼管道(p＜0.001)，運行前期(前14 d)PE和不銹鋼生物膜細菌總數均快速增長，21 d后兩類管材上附著的細菌總數增速放緩，至第56天左右PE管道生物膜細菌總數基本穩定，達7 000～16 000 CFU/cm2，第98天左右不銹鋼管道生物膜細菌總數基本穩定，達2 500～6 000 CFU/cm2.由于塑料管材(PVC、PE等)在輸送水時會向水體中溶出DOC和磷［10］，PE管材生物膜上的微生物可以得到更多的營養物進行增殖生長.不同流速條件下，0.8 m/s下生長的PE和不銹鋼管道生物膜細菌總數均顯著低于同類管材中其他流速下生長的生物膜(p＜0.001)，兩類管材均在0.4 m/s下生長的生物膜細菌總數達最大，但0.2和0.4 m/s下生長的生物膜細菌總數差異均不顯著(p＞0.1)．上述研究結果與Lehtola等［13］的研究相似，小于0.3 m/s流速條件下管道生物膜中的生物量隨流速的增大而增大，在0.5 m/s流速條件下管道生物膜中的微生物由于沖刷作用出現明顯脫落，數量開始減少［13］.研究表明，生物膜上的生物量增加主要是微生物在管壁上的增殖，增加流速有助于主體水中的營養物質向生物膜內部擴散，從而使生物膜中的細菌增殖加快.但是，流速升高，對生物膜的沖刷作用加大，滲透進生物膜內部的消毒劑也增多，因而生物膜的生長也會受到抑制［5］，而當流速達3～4 m/s時才足以使大部分生物膜脫落［13］.因此，生物膜上的細菌會隨著水流速度的增加呈現先增加后顯著減少的趨勢.

圖3 不同實驗裝置生物膜細菌總數隨時間變化

2.3 不同條件下穩定生物膜細菌種群結構變化

在管道生物膜生長達到穩定時，運用PCRDGGE技術研究不同運行條件下的管道生物膜細菌種群結構的變化.由圖4可以看出，管材對生物膜上附著細菌種群的影響要大于流速對其的影響，PE管材和不銹鋼管材間的條帶相似度小于30%，而同種管材內不同流速間的條帶相似度均大于80%.為更進一步研究不同運行條件下管道生物膜的細菌種群結構，從41個條帶中挑取了18個明顯有代表性的條帶進行測序，測序序列經過NCBI比對做成進化樹圖(圖5).由圖4，5可知，變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)在所有6個生物膜樣品中均存在，其中，變形菌門中主要是α變形菌綱(Alphaproteobacteria)和γ變形菌綱(Gammaproteobacteria)，β變形菌綱(Betaproteobacteria)則較少．另外，放線菌門(Actinobacteria)在0.2 m/s流速下生長的PE管道生物膜上也有發現.Zhu等［8］的研究也發現在較高質量濃度余氯下(1.20 mg/L)，α變形菌綱和γ變形菌綱存在較多，β變形菌綱相對較少，這可能是因為β變形菌綱對氯較敏感，α變形菌綱和γ變形菌綱對氯相對較為遲鈍，而且α變形菌綱更能在貧營養條件下生長．

從條帶的相對亮度看，α變形菌綱中的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas echinoides，條帶10)和厚壁菌門中的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus，條帶5)在所有6個生物膜樣品中均存在且相對數量較多，不銹鋼管生物膜中相對含量要高于PE管生物膜.鞘氨醇單胞菌屬能夠利用多種碳源，并且可以分泌胞外聚合物(EPS)，有助于其更迅速地黏附在管壁上，并能抵抗較高質量濃度的氯［14］.芽孢桿菌屬具有特殊的生理多樣性，能夠在不利環境條件下形成芽孢，在度過不利條件后又能重新擴增繁殖，這些具孢子的細菌能夠更加耐氯［15］.由此可見，某些具生理多樣性(孢子)或易分泌胞外聚合物等特殊性質的細菌容易在各類管壁上聚集而成為優勢菌.

圖4 不同運行條件下生物膜樣品的PCR-DGGE凝膠圖譜

從管材和流速上看，PE管上生物膜細菌種群更為豐富，除0.8 m/s流速下生長的不銹鋼管道生物膜外，γ變形菌綱中的假單胞菌目(Pseudomonadales)和α變形菌綱中的根瘤菌目(Rhizobiales)也均存在且相對數量較多，PE管生物膜中相對含量要高于不銹鋼管.某些菌只存在于PE管生物膜中，如β變形菌綱中伯克氏菌目(Burkholderiales)和γ變形菌綱中黃色單胞菌目(Xanthomonadales)的寡養單胞菌(Stenotrophomonas)，隨著流速的增加，菌的相對含量減少，而放線菌門中的微桿菌屬(Microbacterium)和未鑒定的α變形菌綱細菌則只存在于0.2 m/s流速下生長的PE管道生物膜上.Bachmann等［16-17］的研究發現假單胞菌屬(Pseudomonas)、伯克氏菌目中的食酸菌屬(Acidovorax)和根瘤菌目中的甲基桿菌屬(Methylobacterium)細菌在較低流速的生物膜中更具有優勢．伯克氏菌目中的食酸菌屬(Acidovorax)和根瘤菌目中的甲基桿菌屬(Methylobacterium)細菌具有較高的表面疏水性，且細胞的疏水性隨著流速/剪切力的增加而增加［17］，不銹鋼是中度親水性的管材［8］，因此，這些菌在不銹鋼管材上不容易聚集，特別是在流速增大時更難聚集.另外，β變形菌綱中紅環菌屬(Rhodocyclus)只在0.2 m/s流速下生長的不銹鋼管道生物膜上出現，該類菌可能跟鐵的氧化有關［18］，不銹鋼作為一種鐵合金，在該管材上發現該菌也是可能的.

圖5 基于圖4標記的典型DGGE條帶序列構建的進化樹

3 結 論

1)出水余氯、TOC、出水細菌總數在不銹鋼和PE管材間差異極顯著(p＜0.001)，只有PE管材出水余氯在流速間差異顯著(p＜0.05)．

2)管材對生物膜附著細菌總數的影響大于流速，PE管道生物膜細菌總數均顯著大于同一時期不銹鋼管道.不同流速中，生物膜細菌總數先隨著流速的增大而略微增大，進一步加大流速時生物膜細菌總數則顯著減少.PE管道生物膜達穩定的時間要短于不銹鋼管道.不同流速的PE管道生物膜均在第56天左右達到穩定，細菌總數為7 000～16 000 CFU/cm2，不銹鋼管道生物膜均在第98天左右達到穩定，細菌總數為2 500～6 000 CFU/cm2.

3)生物膜中以α變形菌綱、γ變形菌綱和厚壁菌門的芽孢桿菌占優勢，而β變形菌綱和放線菌門相對較少．某些具生理多樣性(孢子)或易分泌胞外聚合物等特殊性質的細菌易在各類管壁上聚集而成為優勢菌，而某些疏水性細菌則較難在不銹鋼管材上聚集，特別在流速增大時更難聚集．

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