甲醛對人支氣管上皮細胞的毒性及N-乙酰半胱氨酸的保護作用

王明科, 陳雙紅, 潘滬湘, 巴劍波, 陶永華,*

1. 海軍醫學研究所，上海 200433 2. 解放軍441醫院，福鼎 355200

甲醛對人支氣管上皮細胞的毒性及N-乙酰半胱氨酸的保護作用

王明科1,2, 陳雙紅1, 潘滬湘1, 巴劍波1, 陶永華1,*

1. 海軍醫學研究所，上海 200433 2. 解放軍441醫院，福鼎 355200

為研究甲醛對人支氣管上皮細胞存活率的影響及N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)的保護效應，以0、50、100、150、200、300和400 μmol·L-1甲醛處理人支氣管上皮BEAS-2B細胞24 h，200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細胞0、6、24和48 h。以不同濃度(0、0.1、1和10 mmol·L-1)NAC預處理1 h或不同時間(預先3、1 h加入NAC、同時加入甲醛和NAC及加入200 μmol·L-1甲醛1、3 h后)加入1 mmol·L-1NAC，再以200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細胞(甲醛處理時間均為24 h)，CCK-8(cell counting kit-8)實驗和倒置相差顯微鏡觀察甲醛對BEAS-2B細胞存活率的影響及NAC的保護作用。結果顯示，甲醛以劑量依賴性方式引起BEAS-2B細胞死亡。200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細胞6 h，細胞存活率下降，與對照組比較差異具有統計學意義(p <0.05)。隨甲醛處理時間的延長細胞存活率明顯下降，存在時間效應關系。不同濃度和不同時間NAC處理可拮抗甲醛引起的細胞存活率下降，存在劑量效應關系，NAC不同時間處理組間細胞存活率未見明顯差異。研究表明，甲醛以劑量和時間依賴性方式引起支氣管上皮細胞存活率下降，NAC以劑量依賴性方式對甲醛引起的損傷具有保護作用。

甲醛；人支氣管上皮細胞；N-乙酰半胱氨酸；保護作用

甲醛是艦船艙室和現代建筑常見的高毒類化學污染物，廣泛地存在于塑料制品、樹脂和建筑材料，也是家庭常用品如食品防腐劑、化妝品、消毒劑和殺菌劑的組分。此外，甲醛也是某些自然活動(如火災)和人類活動(如吸煙和汽車燃料燃燒)的副產物[1-2]。甲醛作為人類致癌物，已被確定可引起鼻咽癌并可能引起白血病，甲醛暴露還可引起其他多種健康問題如急慢性毒性、免疫毒性、造血毒性、生殖毒性、遺傳毒性等，與苯系物還可能存在聯合毒性作用[3-6]。呼吸道吸入是甲醛進入人體的主要方式，呼吸系統也是甲醛侵害人體的首要靶器官。研究發現，甲醛可引起肺組織病理損傷, 炎細胞浸潤，炎性細胞因子表達增強[7-9]，吸入甲醛可加重哮喘大鼠氣道阻力和氣道炎癥反應[10]，也被用來制作急性肺水腫模型[11]，利用流行病學調查方法發現甲醛作業工人阻塞性肺功能通氣功能障礙異常率增高[12]，室內甲醛濃度過高引起居民產生呼吸系統癥狀的危險性增大[13]，但職業性甲醛暴露與肺癌的關系目前尚有爭論[14]。神經源性炎癥、遺傳毒性和致突變性、氧化損傷、表觀遺傳學改變等機制可能與甲醛對呼吸系統的毒性作用有關[15-18]。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是天然存在的氨基酸L-半胱氨酸乙酰化的衍生物，分子內含有-SH基團，具有抗氧化、抗誘變、抗癌等多種藥理特性，作為經典的化痰藥物最早應用于上世紀60年代，現已被用于慢性阻塞性肺病、流行性感冒、急性肺損傷、特發性肺間質纖維化等多種呼吸系統疾病的治療，對癌癥、藥物及重金屬中毒、心臟病、帕金森氏病、吸煙損害、消化系疾病如肝炎、胰腺炎及其他以自由基氧化損傷為特征的疾病均有潛在的治療作用[19-20]。NAC可通過直接抗氧化及提高細胞內谷胱甘肽含量間接抗氧化、抑制炎癥、調節細胞凋亡和防止核酸分子損傷等多種機制發揮生物學效應[21-22〗。研究報道，NAC能夠減輕尼古丁、內毒素及順鉑等物質誘導的I型肺泡上皮細胞的凋亡[23-25]，也能抑制香煙提取物誘導的II型肺泡上皮細胞凋亡[26]，對甲醛誘導的NIH3T3細胞[27]、成骨細胞[28〗損傷也具有保護作用。此外，NAC還能抑制甲醛誘導的人單核細胞酪氨酸磷酸化[29]，對甲醛引起的小鼠學習記憶能力下降也有保護作用[30-31]。但NAC對甲醛誘導的支氣管上皮細胞損傷是否具有保護作用，目前未見報道。本研究擬以人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)為研究對象，探討甲醛對支氣管上皮細胞存活率的影響及NAC的保護效應。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑

胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibcol，PBS、RMPI 1640培養基購自HyClone，青霉素、鏈霉素購自上海博光。37%甲醛溶液為上海市國藥集團化學試劑有限公司分析純試劑。96孔、24孔細胞培養板購自Corning。CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒、NAC均購自碧云天生物技術研究所。

1.2 細胞

人支氣管上皮細胞株BEAS-2B 購自ATCC(American type culture collection)。

1.3 儀器

Model 3110 CO2恒溫培養箱為美國Thermo公司產品。SW-CJ-1F超凈工作臺購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。μQuant MQX200 酶標儀為美國Bio-Tek公司產品。CKX31倒置相差顯微鏡購自日本Olympus，MD50數碼顯微成像系統購自廣州明美。

1.4 實驗方法

1.4.1 BEAS-2B細胞的培養

參考ATCC提供的方法，常規復蘇BEAS-2B細胞，采用含100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素、10%胎牛血清的RMPI 1640培養基，在37℃、5% CO2培養箱中培養傳代，每2～3天換一次液。取對數生長期細胞實驗。

1.4.2 CCK-8實驗

根據CCK-8試劑盒提供的說明書操作，步驟簡要介紹如下：取生長狀態良好的BEAS-2B細胞，0.25%胰蛋白酶消化后按1×104/孔接種于96孔培養板，37℃、5% CO2條件下培養，細胞貼壁后將BEAS-2B細胞分成：(1) 空白組：加入細胞培養液但不種植細胞。(2)對照組：細胞正常培養。(3)實驗組：不同實驗處理。根據實驗分組處理后取對照組和實驗組各5或6孔，空白組1孔，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37℃孵育1～3 h。選擇450 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度(D)值。按以下公式計算細胞存活率：細胞存活率=(D實驗組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100%。

1.4.3 甲醛對BEAS-2B細胞的毒性

不同濃度甲醛對BEAS-2B細胞的損傷：取對數生長期的BEAS-2B細胞，0.25%胰蛋白酶常規消化后按5×104/孔接種于24孔培養板，37℃、5% CO2條件下培養，細胞貼壁后在100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素、10%胎牛血清的RMPI 1640培養基中加入終濃度0、50、100、200和400 μmol·L-1甲醛處理24 h，倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化，照相保存結果。取對數生長期的BEAS-2B細胞，按1×104/孔接種于96孔培養板，37℃、5% CO2條件下培養，細胞貼壁后加入終濃度0、50、100、150、200、300和400 μmol·L-1甲醛處理24 h，CCK-8實驗檢測計算細胞存活率，利用SPSS18.0軟件以細胞存活率對劑量作圖，計算半數抑制濃度IC50。

甲醛處理不同時間對BEAS-2B細胞的損傷：取對數生長期的BEAS-2B細胞，0.25%胰蛋白酶常規消化后按1×104/孔接種于96孔培養板，37℃、5% CO2條件下培養，細胞貼壁后加入終濃度200 μmol·L-1甲醛處理0、6、24和48 h，CCK-8實驗檢測計算細胞存活率。

1.4.4 NAC對甲醛致BEAS-2B細胞損傷的保護作用

取對數生長期的BEAS-2B細胞，0.25%胰蛋白酶常規消化后按5×104/孔接種于24孔培養板，37℃、5% CO2條件下培養，細胞貼壁后將BEAS-2B細胞分成：(1) 對照組：細胞正常培養。(2)甲醛組：在100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素、10%胎牛血清的RMPI 1640培養基加入終濃度為200 μmol·L-1甲醛。(3)NAC+甲醛組：加入1 mmol·L-1NAC預處理BEAS-2B細胞1 h，再加入終濃度為200 μmol·L-1甲醛。37℃、5% CO2條件下培養24 h，倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化，照相保存結果。

不同濃度NAC對甲醛致BEAS-2B細胞損傷的保護作用：取對數生長期的BEAS-2B細胞，0.25%胰蛋白酶常規消化后按1×104/孔接種于96孔培養板，37℃、5% CO2條件下培養，細胞貼壁后加入不同濃度(0、0.1、1和10 mmol·L-1)NAC預處理1 h，再以200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細胞24 h，同時以BEAS-2B細胞正常培養為對照組，CCK-8實驗檢測計算細胞存活率。

NAC不同時間對甲醛致BEAS-2B細胞損傷的保護作用：取對數生長期的BEAS-2B細胞，0.25%胰蛋白酶常規消化后按1×104/孔接種于96孔培養板，37℃、5% CO2條件下培養，細胞貼壁后在不同時間(預先3、1 h、同時加入及加入200 μmol·L-1甲醛1、3 h后)加入1 mmol·L-1NAC，再以200 μmol·L-1甲醛處理(NAC不同時間組甲醛處理時間均為24 h)，同時設立BEAS-2B細胞正常培養組及200 μmol·L-1甲醛處理24 h組，CCK-8實驗檢測計算細胞存活率。

1.4.5 統計學方法

2 結果(Results)

2.1 不同濃度甲醛對BEAS-2B細胞的損傷

正常培養條件下人支氣管上皮BEAS-2B細胞呈貼壁單層生長，梭形或多角形，相鄰細胞間連接較為緊密(圖1A)。50、100 μmol·L-1甲醛處理24 h倒置顯微鏡觀察可見少量BEAS-2B細胞死亡(圖1B和C)，200 μmol·L-1甲醛處理24 h后倒置顯微鏡觀察可見BEAS-2B細胞大量細胞變圓，培養液中有碎片漂浮(圖1D)。400 μmol·L-1甲醛處理24 h后BEAS-2B細胞死亡進一步加重(圖1E)。圖2是CCK-8實驗檢測計算后的細胞存活曲線，50 μmol·L-1甲醛處理24 h后與正常對照組比較BEAS-2B細胞存活率即下降(圖2)，差異具有統計學意義(p <0.05)。100 μmol·L-1與50 μmol·L-1甲醛組細胞存活率無明顯差異(p >0.05)，隨甲醛劑量增加BEAS-2B細胞存活率下降，存在劑量效應關系，利用SPSS18.0軟件以細胞存活率對劑量作圖，可得甲醛的半數抑制濃度IC50為146.15 μmol·L-1。

圖1 不同濃度甲醛對BEAS-2B細胞的損傷，A、B、C、D、E中甲醛濃度分別為0、50、100、200和400 μmol·L-1Fig. 1 BEAS-2B cells damage after exposure to different concentrations of formaldehyde at 0(A), 50(B), 100(C), 200(D) and 400 μmol·L-1(E)

圖2 甲醛處理后BEAS-2B細胞存活曲線注：*: p<0.05，與對照組比較，a、b、c和d: p<0.05，分別與50、100、150和200 μmol·L-1甲醛組比較。Fig. 2 The survival curve of BEAS-2B cells induced by formaldehydeNote： *: p<0.05, compared with the control group，a, b, c and d: p<0.05，compared with the formaldehyde group at 50, 100, 150 and 200 μmol·L-1 respectively.

2.2 甲醛處理不同時間對BEAS-2B細胞存活率的影響

通過CCK-8實驗檢測后發現，200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細胞6 h與對照組比較細胞存活率下降，為58.02%±8.36%，差異具有統計學意義(p <0.05)。200 μmol·L-1甲醛處理24、48 h BEAS-2B細胞存活率繼續下降，分別為28.27%±7.94%、16.65%±1.63%，48 h內隨甲醛處理時間延長BEAS-2B細胞存活率明顯下降(p <0.05)，存在時間效應關系(圖3)。2. 3 NAC對甲醛致BEAS-2B細胞損傷的保護作用

由圖4可見，倒置顯微鏡觀察BEAS-2B細胞正常培養條件下呈現支氣管上皮貼壁單層生長、梭形或多角形、相鄰細胞間連接較為緊密的細胞學形態學特點(圖4A)。200 μmol·L-1甲醛處理24 h后可見大量細胞死亡 (圖4B)。加入1 mmol·L-1NAC預處理1 h可使死亡細胞減少，相鄰細胞間恢復緊密連接狀態，說明NAC可減少甲醛誘導的BEAS-2B細胞死亡，NAC對甲醛誘導的BEAS-2B細胞損傷具有保護效應(圖4C)。

圖3 200 μmol·L-1甲醛處理不同時間對BEAS-2B細胞存活率的影響注：*: p< 0.05，與對照組比較，a: p<0.05，與甲醛組處理6 h比較，b: p< 0.05，與甲醛組處理24 h比較Fig. 3 Time-effect of 200 μmol·L-1 formaldehyde on the viability of BEAS-2B cellsNote: *: p< 0.05, compared with the control group，a: p< 0.05, compared with the formaldehyde group treated for 6 h，b: p< 0.05, compared with the formaldehyde group treated for 24 h

圖4 NAC對甲醛致BEAS-2B細胞損傷的保護作用A：對照組，B：甲醛組，C：NAC+甲醛組Fig. 4 The protective effect of NAC on formaldehyde-induced BEAS-2B cells damageA: control group, B: formaldehyde group, C: NAC+formaldehyde group

由圖5可見，不同濃度(0、0.1、1和10 mmol·L-1)NAC預處理1 h，再以200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細胞24 h，CCK-8實驗檢測計算細胞存活率，1、10 mmol·L-1NAC預處理1 h組細胞存活率分別為68.94%±4.76%、104.10%±5.03%，與未用NAC預處理組比較細胞存活率均明顯升高，差異具有統計學意義(p <0.05)。10 mmol·L-1NAC預處理組與正常培養組細胞存活率已無明顯差異(p >0.05)，NAC對甲醛誘導BEAS-2B細胞損傷的保護作用存在劑量效應關系。

由圖6可見，預先3 h加入NAC再以NAC+甲醛處理、預先1 h加入NAC再以NAC+甲醛處理、同時加入甲醛和NAC及加入甲醛1 h后再以NAC+甲醛處理、加入甲醛3 h后再以NAC+甲醛處理，CCK-8實驗檢測計算BEAS-2B細胞存活率，NAC預處理、同時加入甲醛和NAC及NAC后處理組細胞存活率與甲醛組比較細胞存活率均明顯升高，差異具有統計學意義(p<0.05)，但NAC預處理、同時加入甲醛和NAC及NAC后處理各組之間細胞存活率無明顯差異(p>0.05)，說明預先3 h加入NAC、預先1 h加入NAC、同時加入甲醛和NAC及加入甲醛1 h后再加入NAC、加入甲醛3 h后再加入NAC均對甲醛誘導的BEAS-2B細胞損傷具有保護效應。

3 討論(Discussion)

Persoz等[32]通過研究肺泡上皮細胞A549和支氣管上皮細胞BEAS-2B甲醛暴露24 h后炎癥因子白介素-8(interleukin 8, IL-8)和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)的變化，發現甲醛可能加重嚴重哮喘呼吸道的炎癥反應，甚至可和其他空氣污染物如變應原起協同效果。甲醛還能以劑量依賴性方式誘導肺泡上皮細胞A549細胞凋亡，機制可能是甲醛通過激活p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)信號通路而下調重要的內源性抗氧化分子過氧化物酶2(peroxiredoxin 2, Prx 2)表達[33]。CCK-8實驗是一種基于可溶性噻唑鹽WST-8而廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測，具有快速、高靈敏度的特點，原理是WST-8在電子耦合試劑存在的情況下，可被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的Formazan。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。通過酶標儀檢測吸光度值即可檢測細胞增殖的快慢和對細胞毒性的高低。本實驗通過不同濃度(50～400 μmol·L-1)的甲醛處理人支氣管上皮細胞BEAS-2B，CCK-8實驗和倒置相差顯微鏡觀察發現50、100 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細胞24 h細胞存活率下降，150、200 μmol·L-1甲醛處理BEAS-2B細胞存活率持續下降，繼續增加濃度至300、400 μmol·L-1甲醛可使BEAS-2B細胞死亡進一步加重，說明甲醛可以濃度依賴性方式引起支氣管上皮細胞BEAS-2B損傷。繪制細胞存活曲線后利用SPSS18.0軟件以細胞存活率對劑量作圖，可得甲醛的半數抑制濃度IC50為146.15 μmol·L-1，可為甲醛毒性實驗提供參考。通過CCK-8檢測甲醛處理不同時間對支氣管上皮存活率的影響，結果顯示，48 h內隨甲醛處理時間延長細胞存活率明顯下降，BEAS-2B細胞存活率與甲醛處理時間存在時間效應關系。甲醛可以劑量和時間依賴性方式引起支氣管上皮細胞存活率下降，具體機制有待下一步實驗研究。

圖5 不同濃度NAC對甲醛致BEAS-2B細胞損傷的保護作用注：*: p<0.05，與對照組比較，a、b和c: p<0.05，分別與0、0.1和1 mmol·L-1 NAC組比較Fig. 5 The protective effect of NAC at different concentrations on formaldehyde-induced BEAS-2B cells damageNote: *: p<0.05, compared with the control group，a, b and c: p<0.05，compared with the NAC group at 0, 0.1 and 1 mmol·L-1 respectively

圖6 NAC不同時間對甲醛致BEAS-2B細胞損傷的保護作用注：*: p<0.05，與對照組比較，a: p<0.05，與甲醛組比較。Fig. 6 The protective effect of NAC at different times on formaldehyde-induced BEAS-2B cells damageNote: *: p<0.05, compared with the control group，a: p<0.05，compared with the formaldehyde(FA) group.

NAC是天然存在的氨基酸L-半胱氨酸乙?；难苌?，已被廣泛應用于臨床[19]，并可能通過多種機制對甲醛誘導的肺損傷有保護作用[34]。國內外研究表明，NAC可抑制甲醛誘導的單核細胞還原型/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比率減少，拮抗其p38 MAPK磷酸化[35]。NAC對甲醛誘導的NIH3T3細胞[27]、成骨細胞[28]損傷也具有保護作用。NAC預處理能顯著逆轉甲醛引起的T細胞γ-干擾素減少和DNA損傷誘導基因45α和糖皮質激素亮氨酸拉鏈基因mRNA表達增加[36]。馮丫娟等[30-31]研究發現NAC對甲醛引起的小鼠學習記憶能力下降也有保護作用。因此，推測NAC可能對甲醛誘導的支氣管上皮細胞損傷也具有保護作用。我們首先通過倒置顯微鏡觀察發現，200 μmol·L-1甲醛處理24 h 可引起BEAS-2B細胞大量細胞死亡，加入1 mmol·L-1NAC預處理1 h可顯著減少甲醛誘導的BEAS-2B細胞死亡，說明NAC對甲醛誘導的BEAS-2B細胞損傷具有保護效應。接著，通過CCK-8檢測不同濃度NAC預處理或不同時間NAC處理對甲醛致BEAS-2B細胞存活率的影響，結果顯示NAC可以劑量依賴性方式對甲醛引起的BEAS-2B細胞損傷具有保護效應，預先3、1 h、同時加入及200 μmol·L-1甲醛處理1、3 h后再加入NAC均可拮抗甲醛引起的BEAS-2B細胞存活率下降(雖然NAC不同時間處理組間細胞存活率未見明顯差異)，為NAC可能在將來作為一種具有臨床開發前景的治療甲醛誘導呼吸道上皮損傷的藥物提供了實驗基礎，下一步將研究NAC對甲醛致支氣管上皮細胞損傷保護效應的分子機制，為甲醛對呼吸道上皮損傷的評價及制訂有效防治措施提供參考。

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ProtectiveEffectofN-acetylcysteineonFormaldehyde-inducedDamageinHumanBronchialEpithelialCells

Wang Mingke1,2, Chen Shuanghong1, Pan Huxiang1, Ba Jianbo1, Tao Yonghua1，*

1. Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433, China 2. No. 441 Hospital of PLA, Fuding 355200, China

22 July 2013accepted18 September 2013PublisheddateonCNKIdatabases:28 November 2013

To investigate the effect of formaldehyde on the cell viability of human bronchial epithelial cells (BEAS-2B)，and examine the protective effect of N-acetylcysteine(NAC), BEAS-2B cells were treated for 24 h by different concentrations (0, 50, 100, 150，200，300 and 400 μmol·L-1) of formaldehyde in different times(0, 6, 24 and 48 h) by 200 μmol·L-1formaldehyde. In order to study the effect of NAC on the formaldehyde-induced cell damage, BEAS-2B cells were pretreated with different concentrations (0, 0.1, 1 and 10 mmol L-1) of NAC for 1 h or treated for different times (pretreated with 3 and 1 h, simultaneous treated, posttreated with 1 and 3 h) by 1 mmol L-1NAC, and exposed to 200 μmol·L-1formaldehyde (all group treated by formaldehyde for 24 h). Cell viability was detected by cell counting kit-8(CCK-8) or under an inverted phase-contrast microscope. Results showed that formaldehyde can induce BEAS-2B cells death in a dose-dependent manner. After treated with 200 μmol·L-1formaldehyde for 6 h，the cell survival rate was significantly lower than that of the control group (p <0.05), and a time-dependent decline in survival of formaldehyde-treated cells was detected. NAC attenuated the decline in survival rate of BEAS-2B cells induced by formaldehyde at different concentrations in a dose-dependent manner, and had an antagonistic action on formaldehyde-induced cell damage at different times. Moreover, in our experiment no significant differences of cell viability were observed between the NAC groups at different times. Therefore, it is demonstrated that the viability of bronchial epithelial cells exposed to formaldehyde declines in a dose and time-dependent manner, and NAC has a protective effect in a dose-dependent manner.

formaldehyde; human bronchial epithelial cells; N-acetylcysteine; protective effect

總后勤部重點科研項目(BHJ12J004)；上海市衛生局科研課題計劃資助項目(20124Y178)；中國博士后科學基金資助項目(2013M542529)

王明科(1983-)，男，博士，研究方向為環境科學及干細胞，E-mail: mingkew@gmail.com

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: tyhsci@sina.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20130722002 優先出版網址：www. cnki. net/kcms/detail/11.5470. x. 20131128.1458.001. html

2013-07-22錄用日期：2013-09-18 < class="emphasis_bold">網絡出版時間

時間：2013-11-28

1673-5897(2014)1-145-08

： X171.5

： A

陶永華(1964—)，男，理學碩士，研究員，主要研究方向為環境科學。

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