離子液體[C8mim]Cl對泥鰍胚胎和仔魚的毒性

南平，王瓊瓊，亓蒙，翟勝娜，張玉玲，易叔紅，常重杰

河南師范大學 生命科學學院，新鄉 453007

離子液體[C8mim]Cl對泥鰍胚胎和仔魚的毒性

南平，王瓊瓊，亓蒙，翟勝娜，張玉玲，易叔紅，常重杰*

河南師范大學 生命科學學院，新鄉 453007

以泥鰍的胚胎及仔魚為試驗材料，選擇胚胎發育的4個不同時期(囊胚期、原腸胚中期、神經胚期、尾芽期)及仔魚期為處理開始的時間點，探討了離子液體[C8mim]Cl的毒性作用。結果表明，隨著[C8mim]Cl濃度增加，泥鰍胚胎的孵化率下降，畸形率上升，具有明顯的劑量-效應關系，67～150 mg·L-1的[C8mim]Cl對泥鰍胚胎均表現出明顯的致畸毒性效應；隨著[C8mim]Cl濃度增加，泥鰍仔魚死亡率上升，而100～225 mg·L-1的[C8mim]Cl對泥鰍仔魚具有明顯的致畸、致死作用。其中，[C8mim]Cl對孵出期泥鰍仔魚的24 h、48 h的半致死濃度分別為97.95和86.77 mg·L-1；而[C8mim]Cl對孵出后3 d泥鰍仔魚的24 h、48 h的半致死濃度分別為73.77和40.98 mg·L-1。由上可知,在一定的劑量內，[C8mim]Cl對泥鰍胚胎及仔魚的發育有明顯的致畸、致死作用，這為離子液體[C8mim]Cl的合理使用提供了理論依據。

泥鰍；[C8mim]Cl；胚胎發育；毒性

離子液體是一類完全由離子組成的室溫下呈液態的新型化學試劑，因其不揮發、不易燃和熱穩定等優勢，具有廣闊的應用前景，曾被認為是環境友好的“綠色溶劑”。然而近幾年研究發現離子液體對環境和生物體有潛在風險，有些離子液體甚至是強毒性的[1-2]。此外，大部分離子液體水溶性較強，在其合成和應用中，它們很可能通過廢液殘留、工業污水排放等途徑進入水體中，從而對環境特別是水環境產生潛在的威脅[3]。目前，有關離子液體生物毒性的研究還處于初步階段，國內外的研究報告多集中于不同類型的離子液體對各種生物體的急性毒性效應方面[3-5]。本研究以泥鰍為受試動物，研究了離子液體對水生生物的胚胎發育毒性和仔魚的生物毒性效應，旨在探討離子液體對水生生物的毒性影響。

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)屬鯉形目、鰍科、泥鰍屬，分布較廣，且易于在實驗室飼養。因此，在毒性試驗研究中，是理想的水生生物試驗材料[6]。另外，已有研究表明：魚類的胚胎期和仔魚期是整個生活史中對各種藥物最為敏感的時期[7]。因此，可以利用其胚胎和仔魚來評價多種化合物及各種環境的毒性影響。目前，已有關于斑馬魚、金魚、草魚、鯉魚、黑鯛等水生生物胚胎毒性試驗的報道[8-12]，但有關咪唑類離子液體氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Cl)對泥鰍的胚胎毒性的研究尚未見報道。本研究探討了[C8mim]Cl對泥鰍胚胎及仔魚的毒性影響，從而為制定離子液體[C8mim]Cl水衛生標準及漁業用水水質標準提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

成體泥鰍(體重20～30 g，體長 13～17 cm)，購于河南新鄉市鴻達市場。[C8mim]Cl，純度>99%，購自上海成捷化學有限公司；絨毛膜促性腺激素(HCG)，購于新鄉市獸醫藥店。

1.2 實驗方法

受精卵的制備：在生殖季節，選取性成熟雌雄泥鰍各10尾，采用背部肌肉注射法注射獸用絨毛膜促性素(HCG)，其中雌魚為800 IU·尾-1；雄魚注射劑量減半。10～14 h 后，輕壓雌鰍腹部，立即將卵收集于不同的培養皿中，干法受精[2]，獲得受精卵，備用。

試驗設計：參照預實驗的結果，設30、44、67、100、150、225 mg·L-1共6個處理組和1個空白對照組，每組均設3個平行樣，置于直徑12 cm的培養皿中(100受精卵/培養皿)。在胚胎染毒組，選取30～150 mg·L-1共5個處理濃度的離子液體溶液[C8mim]Cl(100 mL/培養皿)，分別于囊胚期、原腸胚中期、神經胚期和尾芽期開始處理；而在仔魚孵出期和卵黃吸收期則選擇44～225 mg·L-1共5個處理濃度的[C8mim]Cl(100 mL/培養皿)進行染毒處理，每24 h更新其相應的處理液、及時剔除死亡個體，并利用解剖顯微鏡連續觀察其發育狀況并及時拍照、記錄。其中仔魚各處理組在處理48 h后終止試驗(仔魚卵黃囊吸收完畢后每天上、下午各投喂1次蛋黃)，其他處理組在仔魚孵化出后即終止試驗。根據文獻[2]的計算公式，計算出各處理組的胚胎孵化率、畸形率，及其仔魚半致死濃度，并推算出其相應的安全濃度。

1.3 數據統計分析

所有數據均采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用最小顯著差數法(LSD)進行多重比較，同時還利用了Excel 2003進行分析作圖，數據結果用平均數±標準差表示。顯著性差異以p值表示，p< 0.05(*)表示差異顯著；p< 0.01(**)表示差異極顯著。

2 結果(Results)

2.1 [C8mim]Cl對泥鰍胚胎孵化率、畸形率的影響

[C8mim]Cl對泥鰍胚胎發育的影響如圖1和圖2所示。總體而言，其胚胎的主要致畸癥狀表現為：受精卵發育異常，如胚盤異常凸起(圖1A)，胚盤下包異常(圖1B)，胚體渾濁或自行解體(圖1C)；卵黃吸收異常，如卵黃膨大、崩解等(圖1D)。與對照組比較，隨著離子液體[C8mim]Cl濃度的增加，胚胎孵化率下降，其中，較高濃度處理組(100～150 mg·L-1)顯著下降(p< 0.01)，具有明顯的劑量-效應關系；同時，[C8mim]Cl對泥鰍胚胎有明顯的劑量-致畸效應關系，胚胎畸形率隨[C8mim]Cl的濃度增加而上升，其較高處理組(44～150 mg·L-1)的畸形率上升達極顯著水平(p< 0.01)。而比較4個不同處理時期的處理效應，結果發現，從囊胚期開始處理時，胚胎的孵化率受抑制作用最強；而尾芽期開始處理時其胚胎畸形率最顯著。

圖1 [C8mim]Cl對泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)胚胎、仔魚的毒性效應注：A1，正常囊胚；A2，畸形囊胚；B1，正常原腸胚；B2，畸形原腸胚；C1，正常神經胚；C2， 畸形神經胚；D1，正常尾芽；D2，畸形尾芽；E1，正常仔魚；E2，畸形仔魚。Fig. 1 Toxic effect of [C8mim]Cl on the embryos and larvae of loach (Misgurnus anguillicaudatus)Note: A1, normal blastaea; A2, malformed blastaea; B1, normal gastrula; B2, malformed gastrula; C1, normal neurula; C2, malformed neurula; D1, normal tail bud; D2, malformed tail bud; E1 , normal laval fish; E2, malformed laval fish.

圖2 [C8mim]Cl對泥鰍胚胎孵化率和畸形率的影響注：A，囊胚期處理；B，原腸胚期處理；C，神經胚期處理；D，尾芽期處理。Fig. 2 Effect of [C8mim]Cl on the hatching rate and abnormal embryo rate of M. anguillicaudaius embryosNote: A, blastoderm stage processing; B, mid-gastrulae stage processing; C, neurula stage processing; D, tail bud stage processing.

2.2 [C8mim]Cl對泥鰍仔魚死亡率的影響

[C8mim]Cl對泥鰍仔魚死亡率的影響結果如表1所示。在處理1～2 h時，泥鰍仔魚活動開始加快。隨著處理時間的延長，仔魚表現出明顯的致畸癥狀，如彎體或彎尾等(圖1E)，且其攝食能力明顯降低，最終死亡。由表1可知，隨著[C8mim]Cl濃度的增加，泥鰍仔魚的死亡率增加。根據改進的寇氏法(Karber)可推算出[C8mim]Cl對孵出期泥鰍仔魚的24 h、48 h的LC50濃度及安全濃度分別為：97.95、86.77、20.43 mg·L-1，而其對孵出3 d的泥鰍仔魚的24 h、48 h的LC50濃度及安全濃度分別為：73.77、40.98、3.794 mg·L-1。由上可知，剛孵化出的泥鰍仔魚24 h、48 h的LC50濃度及安全濃度均高于孵化后3 d的泥鰍仔魚。

表1 [C8mim]Cl染毒后泥鰍仔魚的死亡率Table 1 Mortality rate of M. anguillicaudaius larvae induced by [C8mim]Cl

3 討論(Discussion)

離子液體因沒有蒸汽壓，在使用過程中本身不會形成揮發性有機物而被稱為“綠色產品”，被認為是工業上揮發性的有機化合物的綠色替代品。但離子液體本身并非“綠色”產品，某些離子液體有毒且難以降解[13-14]。另外，離子液體雖降低了對空氣污染的可能性，但是，因其具有極大的水溶性，排放到環境中后，將對水環境造成危害。因此，Ranke等[15]提出應結合多學科知識對其潛在危害性進行綜合評價。

本研究探討了[C8mim]Cl對泥鰍的胚胎及其仔魚的毒性效應，選擇胚胎發育的4個不同時期(囊胚期、原腸胚期、神經胚期、尾芽期)，以及剛孵化出的仔魚為處理開始的時間點，分別以泥鰍胚胎的孵化率和畸形率，泥鰍仔魚的死亡率為研究指標。結果表明，[C8mim]Cl對泥鰍胚胎及仔魚的發育具有明顯的抑制、致畸、致死作用，如67～150 mg·L-1的[C8mim]Cl對泥鰍胚胎均表現出明顯的致畸毒性效應；隨著[C8mim]Cl的濃度增加，泥鰍仔魚死亡率上升，而100～225 mg·L-1的[C8mim]Cl對泥鰍仔魚具有明顯的致畸、致死作用。其中，[C8mim]Cl對孵出期泥鰍仔魚的24 h、48 h的LC50分別為97.95和86.77 mg·L-1；而[C8mim]Cl對孵出后3 d泥鰍仔魚的24 h、48 h的LC50分別為73.77和 40.98 mg·L-1。這與其他咪唑類離子液體對斑馬魚、大型蚤等其他水生生物具有生物毒性的研究成果一致[16-18]。由上可知，在一定的劑量內，[C8mim]Cl對泥鰍胚胎及仔魚的發育有明顯的致畸、致死作用，這為離子液體[C8mim]Cl的合理使用提供了理論依據。同時，本研究還發現，在神經胚和尾芽期，泥鰍胚胎對[C8mim]Cl的毒性影響較為敏感，其畸形率較其他時期明顯增高。這可能是因為，神經胚期的胚胎正處于高度分化時期，尤其是胚頭部等重要的神經系統在此時趨于形成，此時受到毒性影響，較易形成畸形個體；而尾芽期距孵出期比較短，其卵細胞膜的保護作用有所減弱。同時，本研究結果也說明，不同時期胚胎發育的敏感性有差異。另外，不同孵出期的泥鰍仔魚對[C8mim]Cl的敏感性有差異，孵出后1 d進行處理的仔魚比孵出后3 d進行處理的仔魚的半致死濃度及安全濃度高。這說明，早期幼魚(卵黃吸收期的仔魚：孵出后1～3 d)，營養供給主要是靠卵黃提供，受外界的影響并不大；但隨著發育的進行，幼魚對外界的敏感性增強。該結果與姚紀花等[19]研究重金屬對大鱗副泥鰍胚胎發育和仔魚成活的影響結果基本一致。

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◆

Toxicityof[C8mim]CltoLoachEmbryonicandLarvalFish

Nan Ping, Wang Qiongqiong, Qi Meng, Zhai Shengna, Zhang Yuling, Yi Shuhong, Chang Zhongjie*

College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China

25 July 2013accepted11 November 2013

The toxic effect of chloride-1-helsinki-3-methylimidazolium chinook ([C8mim]Cl) to the embryos and larvae of loach (Misgurnus anguillicaudatus) were studied in this paper. The loaches were exposed to [C8mim]Cl from the beginning of different stages including the embryonic development of blastoderm, mid-gastrula, neurula and tail bud stage, and the larval period. The results showed that the hatching rate of loach embryos decreased and the abnormality of loach embryos increased with the increase of [C8mim]Cl concentration, and a significant dose-response relationship was observed. [C8mim]Cl showed significant toxicity to the loach embryonic development at the concentration between 67 and 150 mg·L-1. The mortality of loach larvae increased with the increase of [C8mim]Cl concentration, and the teratogenic and lethal effect of [C8mim]Cl on the loach larvae was observed at the concentration between 100 and 225 mg·L-1. The 24 h-LC50and 48 h-LC50of the newly hatched larvae were 97.95 and 86.77 mg·L-1, whereas the 24 h-LC50and 48 h-LC50of the 3-day-old larvae were 73.77 and 40.98 mg·L-1. This study provides some useful information for the rational use of [C8mim]Cl.

loach (Misgurnus anguillicaudatus); [C8mim]Cl; embryonic development; toxicity

國家自然科學基金(3071666)；河南師范大學青科基金(01046400067)；河南師范大學研究生創新項目(YL201313)；河南省自然科學基礎與前沿(112300410275)

南平(1979-)，女，博士，講師，研究方向為環境分子毒理學，E-mail: nanspring@sohu.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: changzhongjie@tom.com

10.7524/AJE.1673-5897.20130725001

南平，王瓊瓊，亓蒙，等. 離子液體[C8mim]Cl對泥鰍胚胎和仔魚的毒性研究[J]. 生態毒理學報, 2014, 9(2): 268-272

Nan P, Wang Q Q, Qi M, et al. Studies on toxicity effect of [C8mim]Cl to loach embryonic and larval fish [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(2): 268-272 (in Chinese)

2013-07-25錄用日期2013-11-11

1673-5897(2014)2-268-05

X171.5

A

常重杰(1965—)，男，博士，教授，主要研究方向為分子細胞毒理學，發表學術論文60余篇。