全氟辛烷羧酸(PFOA)與全氟辛烷磺酸(PFOS)的細胞毒性效應

端正花，王勛功，王華，李寧濤，朱琳

1. 天津理工大學環境科學與安全工程學院，天津300384 2. 天津出入境檢驗檢疫局工業產品安全技術中心，天津300191 3. 南開大學環境科學與工程學院，天津300071

全氟辛烷羧酸(PFOA)與全氟辛烷磺酸(PFOS)的細胞毒性效應

端正花1，王勛功1，王華2，李寧濤2，朱琳3,*

1. 天津理工大學環境科學與安全工程學院，天津300384 2. 天津出入境檢驗檢疫局工業產品安全技術中心，天津300191 3. 南開大學環境科學與工程學院，天津300071

新型污染物全氟辛烷羧酸(PFOA)與全氟辛烷磺酸(PFOS)在全球范圍內的各種環境介質中被廣泛檢出，對生態安全和人體健康造成威脅。利用MTT(噻唑藍)法研究了PFOA/PFOS對人體細胞的毒性效應。結果表明，低劑量PFOA和PFOS對人體正常肝細胞增殖具有顯著毒性，其3 d半數抑制濃度(IC50值)分別約為5和0.5 μg·L-1。此外，PFOA和PFOS均對MCF-7細胞增殖表現出顯著的非單調劑量-毒性效應，并且在環境濃度范圍(< 0.6 μg·L-1)內均可促進MCF-7細胞增殖，表現出潛在的類雌激素作用風險。

全氟辛烷羧酸(PFOA); 全氟辛烷磺酸(PFOS)；肝細胞；MCF-7；非單調劑量效應關系

近年來，新型污染物全氟化合物(perfluorinated compounds, PFCs)在生產領域被大規模使用，導致這類物質廣泛進入全球環境。由于很難被降解且具有生物蓄積性，PFCs被認為是一類新型的持久性有機污染物[1]，在水體[2]、生物體[3]、人體組織[4]和食物[5]中被廣泛檢出，甚至在北極地區的生物體及環境介質中均有PFCs檢出[6]。PFCs類化合物最終會部分轉化為全氟辛烷羧酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)，這2種物質是PFCs中應用最為廣泛的，尤其是PFOS，它在生物體內的蓄積水平是二惡英等的數百至數千倍[1]。因此，PFOA和PFOS的毒性研究已成為生態環境污染領域的熱點問題[7-9]。

PFOA與PFOS作為持久性新型環境污染物，已發現其在生物的生殖、發育、神經、免疫、遺傳等方面具有毒性[10]。但是目前PFCs的毒性研究多數集中于哺乳動物的急性毒性研究，且使用的暴露劑量明顯高于環境中的實際含量[11]。PFCs對人類的毒性效應僅限于小范圍人群的流行病學研究[12]。許多種類的外源性物質都有可能對不同的人體細胞產生毒性作用，同時研究發現肝臟比其他內臟更容易富集長鏈的PFCs[13]，因此本實驗首先探討了PFOA與PFOS對人體正常肝細胞株的細胞增殖毒性。另外，據動物體內實驗證明，PFCs具有類雌激素作用[14-15]。因此，本實驗進一步通過研究PFOA與PFOS對雌激素受體陽性乳腺癌細胞株MCF-7的毒性作用，初步分析其類雌激素作用。從而為PFCs的多介質環境行為、健康風險和控制原理的研究提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

人張氏肝細胞株(Chang liver)，購自武漢博士德生物工程有限公司；人乳腺癌細胞株(MCF-7)，南開大學生命科學學院惠贈。PFOS和PFOA(純度≥99.9%)購自Sigma-Aldrich公司，其他試劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

配制PFOS和PFOA母液5 mg·L-1：稱取一定量的PFOS和PFOA粉末，加入少量二甲基亞砜(DMSO)助溶(實際暴露溶液中DMSO的體積分數不超過0.1%，經溶劑對照實驗，此濃度對實驗結果無影響)，再溶于含有10%(質量分數)胎牛血清的1640完全培養基中。

1.2 細胞的傳代和培養

將人體肝細胞和MCF-7細胞分別置于含有10%(質量分數)胎牛血清的1640完全培養基中，在條件為37 ℃、5% CO2的細胞培養箱(美國Thermo, 3110)內培養，每隔2 d更換1次培養基。

吸去培養皿中的完全培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗培養皿，洗去細胞表面上的完全培養基；吸去PBS，加入1 mL胰蛋白酶放入培養箱中消化細胞2 min；取出培養皿加入1 mL完全培養基終止消化；吹散貼在壁上的細胞后，將細胞懸液置于離心管中，以1 000 r·min-1離心(德國Hettich, Rotina 420)3 min；棄去上清液，加入完全培養基用移液槍反復吹散至單細胞狀態，以1/2比例傳代培養。

1.3 MTT法檢測

取對數生長期的人體肝細胞和MCF-7細胞制成單細胞懸液，將細胞懸液接種于96孔板(美國Thermo)，調整細胞懸液的濃度，使每孔加入100 μL細胞懸液后每孔約有1×104個細胞。在37 ℃、5% CO2條件下置于細胞培養箱中培養24 h待細胞貼壁。24 h后吸去每孔中的完全培養基，空白對照組加入含有10%(質量分數)胎牛血清的1640完全培養基100 μL，實驗組分別在每孔中加入含有不同濃度(0、0.5、5、500和5 000 μg·L-1)的PFOS或PFOA的完全培養基100 μL，每組設置個10復孔。將細胞分別培養24 h、48 h和72 h。培養結束后，吸去完全培養基，每孔加入20 μL濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液(噻唑藍溶液)，繼續在培養箱中培養4 h。而后吸去MTT溶液，每孔加入100 μL DMSO溶液，震蕩10 min，用酶標儀(美國Thermo, FC)在492 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值。

1.4 數據統計

實驗所得數據為96孔板各孔的吸光度(A)值，用Excel中的常用函數AVERAGE計算每組10個復孔吸光度(A)值的平均值，用常用函數STDEV計算每組的標準偏差，用統計函數TTEST比較每個濃度組與空白對照組的差異，如p<0.05，則認為有顯著的差異。

2 結果(Results)

2.1 PFOA和PFOS對人體肝細胞的細胞增殖毒性

如圖1所示，3 d內空白對照組人體正常肝細胞都呈對數增長趨勢，說明本實驗細胞體系穩定可靠。

經PFOA和PFOS暴露1 d后，從5 μg·L-1濃度組開始，細胞增殖受到顯著的抑制作用(p(PFOA)=0.006；p(PFOS)=0.005)。暴露2 d后，最低濃度組(0.5 μg·L-1)也都表現為抑制肝細胞增殖(p(PFOA)=0.005；p(PFOS)=0.0005)。PFOA的3 d半數抑制濃度(3 d-IC50)約為5 μg·L-1，而PFOS的3 d-IC50約為0.5 μg·L-1，從這個指標來看，PFOS對肝細胞增殖抑制的毒性更大。

2.2 全氟辛烷羧酸(PFOA)與全氟辛烷磺酸(PFOS)對MCF-7的細胞增殖毒性

如圖2所示，5 d內空白對照組MCF-7都呈對數增長趨勢，說明本實驗細胞體系穩定可靠。

由圖2可見，經PFOA暴露1～3 d后，各濃度組均促進MCF-7細胞增殖(p<0.05)；暴露4 d后低濃度組(0.5 μg·L-1和5 μg·L-1)繼續促進細胞增殖，表現為類雌激素效應，500 μg·L-1組無顯著細胞毒性(p=0.112)，最高濃度組(5 000 μg·L-1)表現出抑制細胞增殖作用(p=0.023)；暴露5 d后低濃度組(0.5 μg·L-1和5 μg·L-1)繼續促進細胞增殖(p<0.05)，500 μg·L-1組無細胞毒性(p=0.272)，最高濃度組(5 000 μg·L-1)抑制細胞增殖(p=0.039)。由此可見，PFOA對MCF-7的細胞增殖表現出非單調劑量-效應毒性。 PFOS暴露1 d后，各濃度組均無毒性效應，而PFOA暴露1 d后甚至最低濃度組(0.5 μg·L-1)都表現出刺激MCF-7細胞增殖作用(p=0.01)，因此從這個指標看PFOA的類雌激素作用更強；暴露2 d后PFOS各濃度組均促進細胞增殖(p<0.05)；暴露3 d后則表現出非單調劑量-效應毒性，即低濃度(0.5、5和500 μg·L-1組)繼續促進細胞增殖(p<0.05)，最高濃度組(5 000 μg·L-1)表現為抑制細胞增殖。可見，PFOA和PFOS對MCF-7細胞增殖的毒性作用總體規律相同。

圖1 PFOA/PFOS對人體肝細胞增殖的毒性作用注：* p<0.05，** p<0.01，與空白對照組相比，下同。Fig. 1 Toxicity of PFOA/PFOS to the proliferation of human liver cellsNote: *p<0.05, ** p<0.01, compared with the control group, the same below.

圖2 PFOA/PFOS對MCF-7細胞增殖的毒性作用Fig. 2 Toxicity of PFOA/PFOS to the proliferation of MCF-7 cells

3 討論(Discussion)

城市工業污水中PFCs的含量較高，比如泰國工業區污水處理廠出水中檢測出的PFCs總濃度高于0.6 μg·L-1[16]。人體血清中PFOA和PFOS的平均濃度約為10 μg·L-1[17]。Liu等[18]以原代培養的羅非魚肝臟細胞為實驗對象，證明高濃度(>1 000 μg·L-1)的PFOA和PFOS具有細胞毒性效應，并且認為目前的污染程度對魚類生殖發育帶來的風險很小。本實驗所選取的最低濃度0.5 μg·L-1低于環境暴露濃度。PFOA和PFOS在該濃度下抑制人正常肝細胞的增殖，并且隨著濃度的增大，抑制作用增強，證明了環境中PFOA和PFOS對于人體正常細胞存在毒性。究其原因，PFOA和PFOS都能誘導氧化自由基(ROS)的產生[19-20]，從而導致肝細胞凋亡。但是本實驗中PFOS對正常肝細胞增殖抑制的IC50值顯著低于PFOA，即PFOS對正常肝細胞增殖抑制的相對毒性較大。這與前人的研究結論是一致的[21-22]。研究發現PFOS和PFOA都能抑制細胞間歇連接通訊這一細胞膜功能[23]，但是PFOS還能提高細胞膜對疏水性配體的滲透性能，從而使PFOS在生物個體中具有較高的生物富集速度，而PFOA的滲透及富集速度則比較緩慢[13]。因此可推測PFOS在同濃度下比PFOA進入生物體速度快，富集速度也快，對生物影響更大。

本實驗以應用最為廣泛的具有環境雌激素受體陽性特征的MCF-7細胞為研究對象，探討了環境濃度的PFOA和PFOS的內分泌干擾風險。Henry等[24]研究發現PFOA在高濃度(3 000 μg·L-1)對MCF-7細胞具有細胞毒性，而在30 μg·L-1則無任何毒性表征。本實驗在高濃度組(5 000 μg·L-1)也發現PFOA和PFOS對MCF-7細胞具有細胞毒性。但是在低濃度范圍(0.5～5 μg·L-1)下，PFOA和PFOS對MCF-7細胞增殖還有具有顯著的促進作用，提示其在環境濃度下具有類雌激素作用。PFOA和PFOS對MCF-7的細胞毒性存在非單調劑量-毒性效應。暴露1 d后，PFOS各濃度組均無毒性效應，而PFOA甚至在最低濃度組(0.5 μg·L-1)表現出刺激MCF-7細胞增殖，從這個指標看PFOA的類雌激素作用更為明顯。據報道PFOA能抑制G-蛋白偶聯的受體蛋白信號通路[25]。G-蛋白偶聯的雌激素受體(G protein-coupled estrogen receptor1, GPER)是迄今發現的最重要的雌激素膜性受體[26]。但是，是否由于這些特性的異同造成PFOA和PFOS類雌激素效應的差距，還有待于進一步分析。

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TheCytotoxicEffectofPFOAandPFOS

Duan Zhenghua1, Wang Xungong1, Wang Hua2, Li Ningtao2, Zhu Lin3,*

1. School of Environmental Science and Safety Engineering, Tianjin University of Technology, Tianjin 300384, China 2. Technical Center for Safety of Industrial Products, Tianjin Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau, Tianjin 300191, China 3. College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China

6 December 2013accepted3 January 2014

The new pollutants perfluorooctanoic acid (PFOA) and perfluorooctane sulfonate (PFOS) is widely detected in various media within global scope, and thus posing a hazard to environment and human health. The cytotoxic effect of PFOA and PFOS was studied with the method of MTT in this paper. The results showed that low-dose PFOA/PFOS exposure had significant toxicities to the proliferation of normal human liver cells, and the values of their 3 d half maximal inhibitory concentration (IC50) were 5 and 0.5 μg·L-1. Meanwhile, both of PFOA and PFOS had significant non monotonic dose-effect relationship in the toxicity to the proliferation of MCF-7 cells, and they could promote the proliferation of MCF-7 cells within the scope of environmental concentrations (< 0.6 μg·L-1), which showed their potential estrogen actions.

PFOA；PFOS; liver cell; MCF-7; non monotonic dose-effect

國家質檢總局科技計劃項目(2012IK213)

端正花(1981-)，女，博士，講師，主要研究方向為環境生物技術，E-mail: duanzhenghua@mail.nankai.edu.cn；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: zhulin@nankai.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20131206001

端正花, 王勛功, 王華，等. 全氟辛烷羧酸PFOA與全氟辛烷磺酸PFOS的細胞毒性效應研究[J]. 生態毒理學報, 2014, 9(2): 353-357

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2013-12-06錄用日期2014-01-03

1673-5897(2014)2-353-05

X171.5

A

朱琳(1957—)，男，環境科學博士，教授，主要研究方向為生態毒理學和環境生物學，發表學術論文30余篇。