恒定低溫下桃小食心蟲越冬幼蟲體內生化物質變化及耐寒性研究

趙楠　郭婷婷　于毅等

摘要：為研究低溫冷藏對桃小食心蟲越冬幼蟲耐寒能力的影響，測定了4℃低溫冷藏90～210 d期間其過冷卻點（SCP）、結冰點（FP）以及甘油、海藻糖和氨基酸含量的變化。結果顯示：冷藏時間對桃小食心蟲的過冷卻點和結冰點影響顯著，冷藏90～210 d期間其SCP和FP先升高后降低，第180 d最高（-7.73℃和-4.67℃），第210 d最低（-13.35℃和-10.58℃）；甘油含量在冷藏第150 d最高（21.37 μg/mg），而此時海藻糖含量最低（21.78 μg/mg）；在冷藏期間蟲體內均檢測到17種氨基酸，冷藏第180 d谷氨酸含量達到最高（3.73 mg/100mg）。

關鍵詞：桃小食心蟲；低溫冷藏；過冷卻點；甘油；海藻糖；氨基酸

中圖分類號：S186文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）07-0107-05

AbstractTo investigate the effects of cold storage on cold tolerance of Carposina sasakii Matsumura （Lepidoptera： Carposinidae） overwintering larvae， the supercooling point （SCP）， freezing point （FP） and variations of glycerinum， trehalose and amino acid contents were measured during stored at 4℃ for 90～210 days. The results indicated that cold storage time had significant influences on SCP and FP of Carposina sasakii Matsumura overwintering larvae. The SCP and FP increased firstly and then decreased during storage， and had the highest values （-7.73℃ and -4.67℃） on the 180th day and the lowest values （-13.35℃ and -10.58℃） on the 210th day respectively. The content of glycerin was the highest （21.37 μg/mg） while that of trehalose was the lowest （21.78 μg/mg） on the 150th day. Seventeen kinds of amino acids were detected throughout the whole cold storage and the content of Glu reached the maximum （3.73 mg/100mg） on the 180th day.

Key wordsCarposina sasakii Matsumura； Cold storage； Supercooling point （SCP）； Glycerin； Trehalose； Amino acids

昆蟲在全球分布廣泛，經歷著復雜的環境變化，其基本行為、生長發育、越冬存活和進化途徑等無不受溫度的影響[1，2]。對于溫帶地區的昆蟲而言，冬季低溫是其存活的重要障礙，其耐寒性的高低已經成為種群生存與發展的重要前提，關系到其分布、繁殖及下一年的發生動態[3]。因此，昆蟲的耐寒性已作為一個熱點領域被廣泛研究[4～6]。在許多昆蟲的耐寒性研究中，過冷卻點（supercooling point，SCP） 和結冰點（freezing point，FP）常用來作為衡量其耐寒性強弱的重要指標[7～11]，昆蟲的過冷卻能力與耐寒性密切相關[8]。昆蟲過冷卻點被發現后的很長一段時間內，人們認為高于過冷卻點以上的低溫對昆蟲是沒有傷害的[8]。Sturgess 和 Goulding[12]及Salt[13]發現高于0℃以上的低溫也會對生物造成生理或物理損害，但麗蠅幼蟲（Calliphora）在溫度達到過冷卻點時卻沒有個體死亡[14]，因此，昆蟲的結冰不耐受性并不意味著昆蟲能忍受結冰以上的任何溫度，時間是這類存活試驗中的一個重要因素[4]。因此，測定恒定低溫下昆蟲的過冷卻能力對研究昆蟲的耐寒性具有重要的意義。已有發現顯示越冬昆蟲體內的水、脂肪、甘油、山梨醇、氨基酸、脂肪酸和總糖類等小分子耐寒性物質也與耐寒性關系密切[11，15～17]。

桃小食心蟲（Carposina sasakii Matsumura）屬鱗翅目（Lepidoptera）蛀果蛾科（Carposinidae），寄主繁多，廣泛分布于我國北部及西北地區蘋果、梨、杏以及山楂產區，是我國北方果區重要害蟲[18，19]。王鵬等[20]曾對桃小食心蟲越冬幼蟲體內的含水量、總蛋白含量、糖原含量和總脂肪含量進行了測定，發現越冬期幼蟲含水量、總蛋白含量、糖原含量的變化均與過冷卻能力變化一致，呈先減后增的趨勢，而總脂肪含量則一直降低，越冬幼蟲體內生理生化物質的動態變化與其抗寒能力密切相關。本試驗著重研究了桃小食心蟲在恒定溫度（4℃）下的過冷卻點、結冰點和甘油、海藻糖、氨基酸含量的動態變化，以期為桃小食心蟲耐寒性研究提供數據支持。

1材料與方法

1.1供試蟲源

桃小食心蟲為2011年10月份采自山東萊蕪地區山楂上脫果自然結繭的健康越冬蟲源。采回后于10月20日存放于盛有濕度為20%鋸末的花盆中（鋸末、花盆經過高溫干燥鼓風烘箱120℃滅菌24 h），花盆表層用保鮮膜覆蓋并封好，將其放于恒溫4℃冰箱中保存待用，從冷藏90 d開始于每月上旬取出適量蟲繭進行不同試驗，試驗時間分別為：冷藏90 d（1月20日）、120 d（2月20日）、 150 d（3月20日）、180 d （4月20日）、 210 d（5月20日），自越冬幼蟲解除滯育至越冬代幼蟲出土止。

1.2桃小食心蟲過冷卻點和結冰點的測定

采用熱電偶方法進行過冷卻點的測定，所用儀器為SUN-Ⅱ型智能昆蟲過冷卻點測定儀。測定時將熱敏電阻的測溫探頭固定在蟲體腹部，以-30℃冰箱作為低溫槽。蟲體的溫度變化經數據采集器采集后輸入計算機，自動記錄測試數據，并繪出溫度變化曲線圖。蟲體溫度隨著環境溫度呈非線性速率降溫，讀出幼蟲的過冷卻點（supercooling point，SCP）值和結冰點（freezing point，FP）值。每次選取20頭健康試蟲進行測定。

1.3桃小食心蟲體內甘油、海藻糖含量的測定

甘油、海藻糖含量的測定方法：低溫冷藏90～210 d，每隔30 d取出適量健康蟲繭，具體測定和標準曲線繪制參考郭海波（2006）[17]和丁慧梅（2011）[21]的方法。

計算方法：蟲體甘油含量（μg/mg）=從標準曲線查得的甘油含量（μg/mL）×樣品稀釋量（mL）/蟲體質量（mg）

蟲體海藻糖含量（μg/mg）=從標準曲線查得的海藻糖含量（μg/mL）×樣品稀釋量（mL）/蟲體質量（mg）

1.4桃小食心蟲體內氨基酸含量的測定

采用日立835-50 型氨基酸自動分析儀對不同冷藏時間的桃小食心蟲體內18種氨基酸的含量進行分析。每次選取不少于10頭桃小食心蟲于60℃烘箱中烘至恒重后研磨成粉末，并轉移至已稱重的聚四氟乙烯試管中，稱重后，加入6 mol/L HCl 10 mL，置于108～110℃烘箱中，水解 24 h，取出后過濾，取上清液1 mL，加1 mL緩沖液，用氨基酸自動分析儀分析，進樣量50 μL。本試驗在山東大學微生物公共實驗室進行。

1.5數據處理

采用SPSS 17.0 for windows軟件進行組間均值數據的One-Way ANOVA方差分析。

2結果與分析

2.1冷藏時間對桃小食心蟲過冷卻點和結冰點的影響

桃小食心蟲的SCP和FP隨著冷藏時間的延長呈現出先上升后下降的趨勢（圖1）。不同冷藏時間桃小食心蟲越冬幼蟲的過冷卻點和結冰點存在顯著性差異（F= 12.82，df=4，P<0.05；F=18.445，df=4，P﹤0.05），冷藏90～180 d，SCP和FP呈現上升趨勢，第180 d時最高，分別為-7.73℃和-4.67℃，第210 d，SCP和FP數值驟降，其值達到最低，分別為-13.35℃和-10.58℃。

3結論與討論

本研究中對SCP和FP的測定結果表明，從冷藏90 d始至180 d（即1月份到4月份），雖然試蟲一直處于4℃恒溫條件下，但其SCP和FP的變化仍與同時期外界環境溫度的變化有著相似的趨勢，是逐漸升高的。推測是因為昆蟲體內生物鐘的原因導致其打破外界恒溫，呈現自然節律的季節性變化。家蠶的研究中也發現類似現象，試驗以體內物質“酯酶A4”計量家蠶休眠時間，不管外界環境如何，時間到了總能打破休眠[22]。這與自然條件下桃小食心蟲越冬幼蟲的過冷卻點和結冰點的變化趨勢略有差異[20]，自然條件下過冷卻點和結冰點最低溫出現在3月份，3～6月份逐漸升高，而本試驗中210 d（5月份）SCP和FP值達到最低，是恒定低溫誘導還是桃小食心蟲自身生理生化物質變化導致其耐寒能力的變化有待進一步探明。

同一昆蟲同一蟲態過冷卻點的分布不盡相同：在潛葉象甲體內，其過冷卻點比較集中，多數在-20℃左右[23]；而一種螨蟲[24]中過冷卻點差異非常大，為-4～-43℃。本研究發現同一批次處理下的桃小食心蟲越冬幼蟲過冷卻點差異較大，范圍為-5.89～-19.91℃（90 d），與上述結果類似，這可能是蟲體自身原因引起的。

昆蟲在越冬期間，隨著冬季到來會做出一系列的生理生化反應以適應冬季低溫[25]。越冬期間昆蟲體內聚集低分子量的糖或醇，如甘油、多元醇、糖等通過增加昆蟲體內束縛水的含量，或直接與酶及其他蛋白質相互作用起到保護生物系統的作用[1]，甘油的合成和積累與多種因素有關，如蟲體水分含量、溫度、光照以及蟲齡等。 Young 和 Block[26]發現短光照、低溫、低濕能誘導Alaskozetes antarcticus（甲螨）體內甘油積累。張擁軍[27]曾發現二化螟越冬幼蟲體內的甘油含量變化與耐寒能力的變化一致。而本研究中桃小食心蟲在冷藏期間甘油含量變化與過冷卻點、結冰點基本一致，可見冷藏過程中桃小食心蟲積累甘油作為體內的耐寒性物質，以提高自身的耐寒能力。昆蟲血淋巴中的氨基酸能調節血淋巴的滲透壓，是昆蟲游離狀態蛋白質的主要構成成分，因此昆蟲體內的游離氨基酸含量與耐寒性也存在相關性[27]。本研究發現，在過冷卻點和結冰點最高的第180 d，谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甘氨酸含量也達到最大值。另外，低溫冷藏期間谷氨酸和天冬氨酸的含量最高，且在冷藏初期至150 d谷氨酸、天冬氨酸所占氨基酸的百分含量均增加，因此推測谷氨酸、天冬氨酸可能是桃小食心蟲越冬的主要耐寒性物質。

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