熱帶作物頑拗型種子保存研究進展

田新民+李洪立+何云+洪青梅+胡文斌+李瓊

摘 要 本文概述頑拗型種子的生理特性和目前主要保存技術，從作物種類和研究內(nèi)容方面詳細闡述了熱帶作物頑拗型種子保存的研究進展，就存在的問題進行深入分析總結，并對未來的研究重點作出展望。

關鍵詞 熱帶作物 ；頑拗型種子 ；保存

分類號 S339.3+2

Research Progress on Recalcitrant Seeds Storage of Tropical Crops

TIAN Xinmin LI Hongli HE Yun HONG Qingmei HU Wenbin LI Qiong

（Tropical Crops Genetic Resources Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China）

Abstract The physiological characters of recalcitrant seeds and its current preservation techniques were summarized. The research progress of seed storage for tropical crops， including the crop types and research focus， were elucidated in detail. Finally， existing problems for the storage recalcitrant seeds were discussed and the future research focus is prospected.

Keywords tropical crops ； recalcitrant seeds ； storage

種質資源主要包括種子、種苗和各種離體材料等，其中種子是種質資源最主要的組成部分，攜帶父母本各一半的遺傳信息，并且易儲運，不易腐爛，占用空間小，繁殖再生能力強，是遺傳育種和作物栽培最直接的原始材料。因此，種子保存是最經(jīng)濟、安全和高效的種質資源保存方式，可以節(jié)約大量的人力和物力。近年來，全球植物物種多樣性迅速減少，拯救和保存植物物種資源被世界各國所高度重視[1]，發(fā)達國家陸續(xù)建立了一批現(xiàn)代化的種質保存庫，中國也建立了多個專業(yè)的種質保存庫，如建立在北京的國家農(nóng)作物種質保存中心和昆明的西南野生生物種質資源庫。近年來，國家重點投資建設的種子保存大項目，經(jīng)過幾年的努力，成功搶救和保存了國內(nèi)大量的珍貴植物種質資源。保存的物種不乏一些重要作物、珍貴瀕危和極端環(huán)境物種資源，但極少涉及熱帶作物頑拗型種子資源。熱帶作物主要包括天然橡膠、木薯、油棕等作物，香蕉、荔枝、芒果等熱帶水果以及咖啡、桂皮、八角等香（飲）料，是重要的國家戰(zhàn)略資源和日常消費品。鑒于熱帶作物對國民經(jīng)濟發(fā)展的重要性，其種質資源的保護尤為重要。中國目前已收集和保存的熱帶作物種質資源達4萬多份[2-3]，包括橡膠樹、木薯、熱帶果樹、熱帶牧草以及熱帶香辛飲料等作物，主要以種質圃的形式保存，占用土地面積大，且易受病蟲害和自然災害（臺風、寒潮等）的破壞，更新和維護成本高，種質的遺傳多樣性也受到了很大的限制。因此，熱帶作物種子的長期、安全保存對熱帶作物種質資源的保護和利用至關重要，與熱帶作物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展息息相關。本文就熱帶作物頑拗型種子特性及其主要保存方法和技術、近年來熱帶作物種子保存的研究進展以及存在的問題進行詳細的論述，并就未來的研究重點作出了展望。

1 頑拗型種子特性

種子類型、種子質量、種皮的完整性、種子含水量以及保存環(huán)境是影響種子壽命的5大因素，其中種子類型是最重要的因素。根據(jù)種子的生理特點，種子可分為正常型種子（orthodox seed）、中間型種子（Intermediate seed）和頑拗型種子（recalcitrate seed）[4-5]。75%～80%的被子植物種子是正常型種子[6-7]，能在-20℃的低溫保存很長一段時間；5%～10%的被子植物種子產(chǎn)生頑拗型種子[8]，在熱帶地區(qū)大約47%的物種種子為頑拗型種子[7，9-11]。10%～15%的被子植物種子為中間型種子，有一定的耐脫水能力，在低溫條件下可以存活一定時間[12]。頑拗型種子與正常型種子的不同在于，頑拗型種子脫離母株時不經(jīng)過成熟脫水期，其含水量相對較高（20%～60%），且對脫水及低溫高度敏感，采收后不久便可自動進入萌發(fā)狀態(tài)，一旦脫水（即使含水量仍很高）即影響其萌發(fā)，導致其生活力的迅速喪失，溫度過高或過低也會嚴重影響其活力，因此不耐貯存，壽命很短，主要包括一些水生植物、熱帶植物以及小部分溫帶植物的種子[4]。此外，同屬內(nèi)的物種間其種子儲藏特性也有一定的差異（如咖啡屬和柑橘屬），種子耐干燥的能力因物種而異，和其在分類學上的親緣關系沒有必然的關聯(lián)[6，13-14]。多數(shù)頑拗型種子含水量降至15%～20%時即受到傷害，并且對0℃以上的低溫敏感。Farrant等[15]根據(jù)忍耐水分虧缺能力的不同，又將頑拗型種子分為低度、中等和高度3類。低度頑拗型種子能忍受一定的水分喪失和較低的溫度，一般分布于亞熱帶和溫帶地區(qū)，如殼斗科櫟屬的板栗、棕櫚科的絲葵等；中度頑拗型種子能忍受中等程度的脫水和稍高的溫度，如可可和橡膠樹；高度頑拗型種子通常分布于熱帶雨林濕地，其脫落酸（abscisic acid，ABA）含量低，缺乏類脫水素蛋白，僅能忍受少量的水分喪失，而且對溫度高度敏感。由于頑拗型種子對低溫脫水的敏感性，給長期貯藏帶來了極大困難，大多數(shù)頑拗型種子又具有極高的經(jīng)濟價值和保存價值，因此對頑拗型種子保存的研究意義顯得尤為重要。熱帶作物種子除去木薯（正常型種子）和極個別作物外[16-18]，大多屬于頑拗型種子，其中熱帶果樹種子全部為頑拗型種子。endprint

關于頑拗型種子不耐脫水貯藏的機理，迄今仍沒有一致的令人滿意的結論。通常認為，頑拗型種子脫水傷害的3個可能位點是：膜、酶和染色體[19]。一些頑拗型種子在脫水時，溶質滲漏大量增加，表明膜的完整性受到破壞[20-21]。關于頑拗型種子脫水時的超微結構變化已有一些報道。坡壘、青皮種子脫水后，導致內(nèi)質網(wǎng)上核糖體減少、質體中淀粉消失及細胞空泡化等。Berjak等[22]也發(fā)現(xiàn)，Landophia kirkii種子在硅膠上干燥15 d后，其胚軸細胞發(fā)生顯著變化，種子死亡時原生質解體。

2 頑拗型種子主要保存方法和技術

2.1 短期保存

根據(jù)頑拗型種子不耐脫水及低溫的生理特性，在不影響種子活力的前提下，應盡可能降低種子貯藏溫度及含水量，減少種子貯藏過程中的代謝活動，并添加殺菌劑保存種子，達到短期貯存的目的。如黃皮種子自然條件下的壽命只有10多天，但將生理成熟期的新鮮黃皮種子部分脫水，加入4%～6%的百菌清，在15℃的溫度條件下裝于塑料袋中貯藏，60 d后仍可保持90%的發(fā)芽率[23]；將橡膠樹種子先進行部分脫水使種皮趨于風干后，置于能換氣的塑料袋中，于15℃下貯存85 d后仍保持90%的發(fā)芽率[24]。這種方法只能有限地延長種子的壽命，且貯藏過程中種子活力仍不斷下降，達不到長期保存的目的。

2.2 超低溫保存

頑拗型種子在適度的水分狀態(tài)和超低溫狀態(tài)下，不僅能維持種子活力，保持組織和細胞形態(tài)的完整性和遺傳穩(wěn)定性，防止物種衰老，還能使種質材料免受病蟲的侵害。在超低溫條件下，細胞內(nèi)的物質代謝和生命活動幾乎完全停止，最大限度地抑制了其生理代謝強度。從理論上講，細胞、組織和器官在超低溫保存過程中不會發(fā)生遺傳變異和性狀的改變[25]。但是，如果生物機體細胞內(nèi)的水在降溫過程中發(fā)生結冰，造成細胞結構的損傷和破壞，最終會導致細胞死亡。因此，超低溫保存的關鍵，是避免降溫過程中細胞內(nèi)結冰。一般來說，隨著溫度的降低，細胞外溶液先于細胞內(nèi)含物結冰，造成細胞內(nèi)外的壓力差，只要降溫速率不超過脫水速度，細胞內(nèi)的水就不斷向外滲透和擴散，細胞原生質溶液逐漸濃縮，細胞內(nèi)含物的冰點也在降低，能有效地遏制細胞內(nèi)溶液結冰。但是，細胞的過度失水可能造成細胞內(nèi)有害物質的積累（如自由基），使得蛋白質和酶的結構發(fā)生改變，從而破壞膜的完整性[25]。在降溫冰凍過程中，避免細胞內(nèi)結冰和過度失水是超低溫保存技術中的核心問題。研究表明，控制冰凍速度和添加冰凍保護劑對防止細胞內(nèi)結冰尤為重要[26-28]。

通常情況下用-196℃的液態(tài)氮快速冷凍[1，29-31]，該技術要求組織快速脫水和制冷，小樣品要求有一定的擴散和熱傳遞速度，以防止冰晶形成[32-33]。一般認為胚是超低溫保存的最佳材料，因為胚是植株的雛形，包含絕大部分的遺傳信息，體積小，在短時間內(nèi)脫水而不影響活力，而且與其他材料相比，胚的耐脫水和耐低溫能力更強[34-39]。因此大多數(shù)頑拗型種子超低溫保存均選用生理成熟期的胚（或胚軸），而且材料越新鮮，效果越理想[15]，也有采用幼胚作外植體的，如可可幼胚[40]。另外，添加冷凍保護劑可防止冷凍和脫水過程中結構的破壞，減少脅迫相關的自由基調(diào)節(jié)的損害[22，29-30]。

3 熱帶作物頑拗型種子保存研究進展

3.1 研究范圍和內(nèi)容

目前，在熱帶作物頑拗型種子保存研究領域，只涉及荔枝、龍眼、橡膠樹、油棕、黃皮、芒果、咖啡、胡椒、可可、澳洲堅果、火龍果等作物，研究報道比較多的有荔枝、龍眼、芒果、橡膠樹和澳洲堅果等種植面積較大的作物，其研究內(nèi)容主要集中于種子在不同采收時間、脫皮方法、成熟度等條件下的萌發(fā)特性，不同溫度和含水量下的種子儲藏特性。另外，對可可、椰子、咖啡等作物胚軸還進行了超低溫保存的探索。但是，到目前為止，部分熱帶作物（如腰果、蓮霧、楊桃等）種子屬性依舊不清楚，其萌發(fā)特性和保存條件方面還沒有相關研究報道。

3.2 研究動態(tài)及進展

3.2.1 荔枝、龍眼

研究結果表明，荔枝和龍眼種子的生長發(fā)育早于其果實，當種子成熟時，果實仍未完全成熟，此時種子鮮重已達高峰，發(fā)芽率為100%，當果實成熟采收時，種子對部分脫水的忍耐力反而下降，表明種子成熟后在果實中又進入了萌發(fā)狀態(tài)，因而不耐脫水。荔枝和龍眼種子發(fā)育早期含水量一直下降，但此時水分總量卻不斷上升，當種子即將成熟時，水分總量維持在較為恒定的水平，在40%以上（荔枝44.6%，龍眼42.5%）[41]。在自然脫水過程中，荔枝和龍眼種子的發(fā)芽率隨含水量下降而降低，至8 d后二者完全喪失發(fā)芽能力，其含水量大概維持在18%[42]。只要種子含水量高于25%，發(fā)芽率就不會受到嚴重影響；但含水量低于25%時，發(fā)芽率急劇下降。當含水量降至20%或更低時，如不及時調(diào)節(jié)干燥環(huán)境，種子將不能再萌發(fā)。因而，種子萌發(fā)率與臨界含水量之間存在著顯著的正相關。當種子含水量低于20%時，種皮逐漸“硬化”，對水幾乎沒有透性。Sowa等[43]通過將麻醉劑（N2O）和氧氣（O2）混合使用來延長荔枝和龍眼種子的壽命，荔枝種子在80%N2O和20%O2條件下存儲，12周以后仍能保持92%的萌芽率；龍眼種子放在80%N2O和20%O2的混合氣體中，7周以后可保持70%的萌芽率。原因可能是N2O對濕潤環(huán)境下的種子呼吸代謝有抑制作用，可以減慢種子的萌發(fā)，同時也能抑制好氧微生物的代謝和生長。麻醉劑N2O和02的混合使用，為人類提供一種貯存頑拗型種子的最新方法和新思路。夏清華等[44]嘗試通過超低溫方法進行荔枝和龍眼胚軸的保存，荔枝和龍眼種子離體胚軸的臨界含水量分別為30%和23%，低于此值時，其生活力迅速下降，高于臨界含水量的龍眼種子離體胚軸，經(jīng)液氮貯存后無一存活。與種子相比，胚軸對脫水的忍耐力更大，而且龍眼胚軸比荔枝胚軸對部分脫水的忍耐力更大[41]。

3.2.2 橡膠樹endprint

橡膠樹種子是典型的頑拗型種子，在成熟落地后隨即萌發(fā)，且萌發(fā)率極高，達到62.7%，對脫水具有高度的敏感性[45-46]，在快速和緩慢脫水條件下的種子致死含水量分別為40.3%和48.9%[47]。研究表明，橡膠樹種皮對種子吸水和萌發(fā)具有明顯的機械限制作用，且萌發(fā)速率系數(shù)隨著溫度的升高先增大后減小[48]。韋煥琦等[49]通過連續(xù)測定不同貯藏條件下種子的電導率、含水量和發(fā)芽率，研究橡膠樹種子的膜透性對其發(fā)芽率的影響，結果表明，在22℃、濕度為95%、包膜度為75%時，橡膠樹種子的電導率增幅最小，內(nèi)含物消耗速率與種子呼吸速率適宜。種子在貯藏過程中電導率不斷升高，表明膜系統(tǒng)受到破壞，導致種子內(nèi)電解質外滲，伴隨著橡膠樹種子含水量和發(fā)芽率的降低。王軍等[50]利用正交試驗在人工氣候箱內(nèi)對橡膠樹種子短期貯藏過程中的溫度、濕度、包膜度最佳組合進行研究，通過對不同處理條件下種子的發(fā)芽率、超氧化物岐化酶（SOD）活性、電導率、堿性磷酸酶等指標的測定分析和比較，建議在生產(chǎn)實踐中，橡膠樹種子短期貯藏最佳的溫度、濕度和包膜度應分別為19～22℃、95%、65%～75%。另外，橡膠樹種子胚軸脫水至臨界含水量后，經(jīng)液氮貯存有70%的存活率，但是存活的胚軸不能產(chǎn)生完整的幼苗[51]。

3.2.3 芒果

關于芒果種子保存方面的研究報道也較多，主要涉及種子脫水與貯藏的關系、保存溫度和儲藏的關系以及儲藏條件的優(yōu)化等方面[52-56]，關于超低溫保存方面的研究還是一片空白，種子對脫水和低溫敏感性機理的研究尚未涉及。王曉峰等[57]發(fā)現(xiàn)用ABA處理芒果種子能降低芒果種子（特別是成熟度較低者）的脫水敏感性，說明抑制或延緩種子萌發(fā)可降低種子對脫水的敏感性，而且芒果種子對脫水的敏感性與其在母株上開始的與萌動相關的一些生理生化變化有關。另外，除貯藏條件外，種子發(fā)育過程中的生理生化變化與種子的壽命也有很大關系[58]。

3.2.4 澳洲堅果

羅萍[59]進行了澳洲堅果種子的萌發(fā)實驗，結果表明，澳洲堅果種子鮮播17～20 d后開始萌發(fā)，25～35 d進入萌發(fā)高峰期，85 d后種子不再萌發(fā)，不同收獲期和不同品種的種子發(fā)芽率也有差異。化學藥劑對接近成熟的澳洲堅果種子萌發(fā)有一定影響。賀熙勇等[60]用赤霉素對不同品種澳洲堅果種子進行了處理，結果表明，赤霉素（100～500 mg/L）處理能極顯著提高種子萌發(fā)率。對種子使用不同脫皮方式后，其萌發(fā)率也有一定差異，人工脫皮種子萌發(fā)率極顯著高于機械脫皮種子[61]。研究表明，不同時期落果的澳洲堅果種子活力與果實的成熟度有密切關系，隨著果實發(fā)育成熟，內(nèi)果皮顏色由淡黃色漸變?yōu)楹稚?月下旬達到生理成熟期，此時種子活力最高，種子出芽率達到84%[62]。

3.2.5 其它

楊華庚[63]研究了胡椒和中粒種咖啡種子在常溫自然貯藏條件下的萌發(fā)特性，結果表明，自然貯藏20 d，干燥脫水對胡椒種子的傷害較輕微，其種子發(fā)芽率和活力指數(shù)仍高達82.7%和1.03；之后由于嚴重脫水，種子發(fā)芽率和活力指數(shù)迅速下降；自然貯藏60 d，其種子含水量下降至10.91%時，完全喪失發(fā)芽力。自然貯藏30 d，干燥脫水對中粒種咖啡種子的傷害較輕微，種子發(fā)芽率仍高達80.5%；之后由于嚴重脫水，種子發(fā)芽率和活力指數(shù)急劇下降；自然貯藏90 d，種子含水量下降至9.81%，種子幾乎完全喪失發(fā)芽力。

將木菠蘿種子先進行部分脫水（含水量約51%），然后放入扎有針孔的袋中，再裝入含水量為50%的珍珠巖袋中，分別在5、10、15℃中貯藏，結果表明，貯于5、10℃中的種子先后發(fā)生低溫傷害；15℃的貯藏效果最佳，種子壽命延長至815 d[64]。2種類型木菠蘿種子在不同貯藏期的發(fā)芽率表明，在相同貯藏期條件下，濕苞木菠蘿種子的發(fā)芽率較干苞木菠蘿種子高；在不同貯藏期條件下，2種類型木菠蘿種子隨采隨播的發(fā)芽率分別達97%和88%；貯藏時間越久，種子的發(fā)芽率越低，貯藏4周后，濕苞和干苞種子發(fā)芽率分別只有32.1%和28.3%[65]。

此外，趙春香等[66]對火龍果種子的萌發(fā)特性進行了探索，結果表明，火龍果種子適宜浸種時間為4～6 h，最適合發(fā)芽的溫度為25℃，某些植物生長調(diào)節(jié)劑如NAA（萘乙酸），IAA（吲哚乙酸）等對火龍果種子萌發(fā)有較好的促進作用。

4 熱帶作物頑拗型種子超低溫保存現(xiàn)狀

利用超低溫保存技術在熱帶作物頑拗型種子保存方面進行的一些探索，除對橡膠樹胚進行液氮超低溫保存外，研究人員還對可可[40]、椰子[67]、油棕[68-70]、咖啡[28]和黃皮[23]等幾種頑拗型熱帶作物種子的超低溫保存進行了研究，通過利用液氮對上述幾種作物的胚軸進行冷凍保存后，發(fā)現(xiàn)僅可可幼胚、椰子胚的胚軸經(jīng)超低溫貯存后產(chǎn)生了幼苗，其余的頑拗型作物種子只保持生根、莖或產(chǎn)生愈傷組織的能力，在培養(yǎng)時間內(nèi)均未能產(chǎn)生完整的幼苗。可以認為，目前對熱帶作物頑拗型種子超低溫保存的研究結果只是初步的，經(jīng)超低溫保存后的恢復生長效果并不理想，距離實際應用還有一定差距。

5 熱帶作物頑拗型種子保存研究存在的問題及展望

隨著人類對物種資源保護意識的不斷加強，目前對頑拗型種子保存的研究已經(jīng)成為國際種子學術會議的熱門課題，但由于頑拗型種子本身的特性和保存難度，目前的研究工作還處于初級階段，研究內(nèi)容的深度與廣度都不夠，世界上只有少數(shù)課題組在進行保存技術和理論方面的研究，且較多的研究工作偏重于貯藏條件與種子發(fā)芽率的關系上，對頑拗型種子的不耐脫水機理和低溫敏感性機理缺乏深入的研究。應用種胚進行超低溫貯藏已有可喜的開端，但只限于少數(shù)頑拗型種子物種，且其在液氮中保存的時間很短，保存后的存活率也不高，大多數(shù)胚（或胚軸）經(jīng)超低溫保存后僅產(chǎn)生愈傷組織、根、莖或不定芽，關于能正常成苗的頑拗型種子的遺傳特性及生長情況也沒有追蹤報道，能否用于生產(chǎn)尚有待試驗。頑拗型種子的超低溫保存仍然面臨很多問題，如頑拗型種子往往比中間型和正常型種子大，大多數(shù)頑拗型種子由于太大而不能在液氮中有效地快速脫水和制冷，部分作物種子的胚軸代謝活躍，或由于胚軸太大而限制了能量的擴散和交換速度，這些因素都大大限制了超低溫保存技術在頑拗型種子保存中的探索和應用。endprint

有關熱帶作物頑拗型種子的研究集中于20世紀80～90年代，近10年來的研究報道相對較少，而且上述研究大多只涉及種子萌發(fā)及影響萌發(fā)的外部和內(nèi)部因素等，保存方法大多只涉及短期保存，僅僅對少數(shù)幾種作物進行了超低溫保存的探索。核心的問題即保存技術還沒有取得實質性的突破和進展，沒有形成完全成熟的保存技術。因此，未來的研究須從低溫和脫水敏感性機理入手，解決理論上的障礙，從理論上取得重大突破，在此基礎上，運用現(xiàn)代科學技術，重點在保存技術上取得更大的突破和進展，完全掌握頑拗型種子保存的核心技術，能夠長期、安全和高效地保存頑拗型種子，從而為熱帶作物種質資源以及世界植物多樣性的保護提供強有力的支撐。另外，加強頑拗型種子保存研究，還應擴大供試種類，從不同植物類群入手，總結出更多有規(guī)律的經(jīng)驗和方法，提高保存后的種子存活率和幼苗的生活力，并跟蹤研究能成苗的植物生長及遺傳特性，為實際應用提供理論依據(jù)。

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