光溫條件對(duì)煙葉唇柱苣苔葉片離體培養(yǎng)的影響

黃賽+潘梅+戚華莎+王景飛+呂德任

基金項(xiàng)目 2013年海南省科學(xué)事業(yè)費(fèi)項(xiàng)目“海南苦苣苔科植物2個(gè)特有種的引種栽培和快繁技術(shù)研究”（瓊財(cái)預(yù)〔2013〕131號(hào)）。

摘要以煙葉唇柱苣苔葉片為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，研究了光照強(qiáng)度和溫度對(duì)煙葉唇柱苣苔葉片離體培養(yǎng)的影響，以期篩選出各培養(yǎng)階段最佳光照強(qiáng)度和溫度。結(jié)果表明，葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳光照強(qiáng)度是1 000 lx，最佳溫度為28 ℃，40 d不定芽誘導(dǎo)率95.83%；不定芽增殖和生根的最佳光照強(qiáng)度是1 500 lx，最佳溫度為28 ℃，40 d不定芽增殖倍數(shù)達(dá)7.24倍，生根率100.00%，平均生根數(shù)多達(dá)21.33條。

關(guān)鍵詞煙葉唇柱苣苔；溫光條件；葉片；不定芽；組織培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)Q949.778.4；Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739（2014）11-0155-02

煙葉唇柱苣苔（Chirita heterotricha Merr.）是苦苣苔科唇柱苣苔屬多年生草本，生于海拔約430 m的山谷林中或溪邊石上[1]，是海南省特有的野生花卉，具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。湯正輝對(duì)煙葉唇柱苣苔葉片不定芽的分化及生根進(jìn)行了研究[2]，但有關(guān)光照及溫度等環(huán)境條件在其離體培養(yǎng)中的影響未見(jiàn)有報(bào)道。本試驗(yàn)以煙葉唇柱苣苔無(wú)菌葉片作為試驗(yàn)材料，研究了不同光照強(qiáng)度和溫度對(duì)葉片不定芽的分化、增殖以及生根的影響，以期篩選出各培養(yǎng)階段最為合適的光照強(qiáng)度和溫度。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

植株采自海南省保亭縣，取幼葉作為外植體材料。供試植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）。基本培養(yǎng)基為MS。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以MS為基本培養(yǎng)基，根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康奶砑又参锷L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA，附加白糖30 g/L、卡拉膠9 g/L，滅菌前pH值為5.8，配制分裝后，于溫度121 ℃、壓力0.14 MPa高溫高壓下滅菌20 min。材料接種后移入培養(yǎng)室，光照強(qiáng)度設(shè)置1 000、1 500、2 000 lx等3個(gè)處理，溫度設(shè)置25、28、31 ℃ 3個(gè)處理，光照時(shí)間8 h/d，每個(gè)處理接種8袋，每袋3個(gè)材料，3次重復(fù)，定期觀察記錄，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1無(wú)菌材料的建立。將煙葉唇柱苣苔的幼嫩葉片在自來(lái)水中洗去污物，用棉花蘸洗潔精液擦拭葉片兩面，沖洗干凈后移入超凈工作臺(tái)，先用75%酒精浸泡10 s，再用0.2‰ HgCl2溶液浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗3次，最后用2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無(wú)菌水沖洗5次。將葉片切成1 cm×1 cm見(jiàn)方的小塊，以葉背朝下接種于MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上。接種15 d后，葉面開(kāi)始膨大隆起，25 d開(kāi)始有小芽點(diǎn)萌動(dòng)，40 d在葉片邊緣、主葉脈基部和葉面處均分化出不定芽。取不定芽葉片作為研究試驗(yàn)材料。

1.3.2不定芽的誘導(dǎo)。

（1）光照強(qiáng)度對(duì)葉片不定芽誘導(dǎo)的影響。取無(wú)菌植株小葉片（約0.5 cm×0.5 cm）以葉背接入MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基[2]，置于溫度28 ℃、不同光照強(qiáng)度的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)。

（2）溫度對(duì)葉片不定芽誘導(dǎo)的影響。取無(wú)菌植株小葉片（約0.5 cm×0.5 cm）以葉背接入MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，置于光照強(qiáng)度1 500 lx、不同溫度的培養(yǎng)室中，40 d后統(tǒng)計(jì)葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)。

1.3.3不定芽的增殖。

（1）光照強(qiáng)度對(duì)不定芽增殖的影響。將單個(gè)不定芽接入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，置于溫度28 ℃、不同光照強(qiáng)度的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)不定芽增殖倍數(shù)。

（2）溫度對(duì)葉片不定芽增殖的影響。將單個(gè)不定芽接入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，置于光照強(qiáng)度1 500 lx、不同溫度的培養(yǎng)室中，40 d后統(tǒng)計(jì)不定芽增殖倍數(shù)。

1.3.4生根培養(yǎng)。

（1）光照強(qiáng)度對(duì)不定芽生根的影響。將高度達(dá)到1.2 cm的不定芽接入MS+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，置于溫度28 ℃、不同光照強(qiáng)度的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽生根率、生根數(shù)、株高。

（2）溫度對(duì)不定芽生根的影響。將高度達(dá)到1.2 cm的不定芽接入MS+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，置于光照強(qiáng)度1 500 lx、不同溫度的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽生根率、生根數(shù)、株高和最長(zhǎng)根。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)算公式為：不定芽誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出芽葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100，平均不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/誘導(dǎo)出芽葉片數(shù)，不定芽增殖倍數(shù)=培養(yǎng)40 d不定芽總數(shù)/接種不定芽數(shù)，生根率（%）=生根植株數(shù)/接種植株數(shù)×100，生根數(shù)=植株生根總數(shù)/生根植株數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果均進(jìn)行方差分析，F(xiàn)測(cè)驗(yàn)顯著后用新復(fù)極差法（SSR）進(jìn)行多重比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均為99%水平。

2結(jié)果與分析

2.1不定芽的誘導(dǎo)

（1）不同光照強(qiáng)度對(duì)煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導(dǎo)的影響。由表1可知，光照強(qiáng)度1 000 lx時(shí)，煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)最高，分別為95.83%和7.10個(gè)/葉，芽的生長(zhǎng)勢(shì)最好；光照強(qiáng)度為1 500 lx時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率較低，為83.33%，平均不定芽數(shù)為5.50個(gè)/葉，芽生長(zhǎng)勢(shì)較差；光照強(qiáng)度2 000 lx時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率最低為68.18%，平均不定芽數(shù)也最小為3.36個(gè)/葉，芽的生長(zhǎng)勢(shì)最差，可見(jiàn)光照強(qiáng)度高于1 000 lx時(shí)不利于芽的分化和生長(zhǎng)，光照強(qiáng)度越高，誘導(dǎo)效果越差。方差分析結(jié)果表明，3種光照強(qiáng)度之間不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)的差異達(dá)到極顯著水平，因此煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導(dǎo)的最適宜光照強(qiáng)度為1 000 lx。

（2）不同溫度對(duì)煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導(dǎo)的影響。由表2可知，培養(yǎng)溫度28 ℃的不定芽誘導(dǎo)效果最好，不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到94.74%，平均每葉分化不定芽數(shù)最多，為7.34個(gè)，極顯著高于其他處理；25 ℃的不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)次之，與31 ℃的不定芽誘導(dǎo)率差異極顯著，而平均不定芽數(shù)差異極不顯著。從生長(zhǎng)勢(shì)看，28 ℃的不定芽生長(zhǎng)勢(shì)最好，25 ℃的次之，31 ℃的最差。因此，煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導(dǎo)最佳溫度為28 ℃。

2.2不定芽增殖

（1）不同光照強(qiáng)度對(duì)煙葉唇柱苣苔不定芽增殖的影響。由表3可知，不同光照強(qiáng)度對(duì)煙葉唇柱苣苔不定芽增殖的影響極大，各處理間的差異達(dá)到極顯著水平，其中1 500 lx的光照強(qiáng)度對(duì)不定芽的誘導(dǎo)生長(zhǎng)效果最好，40 d不定芽增殖倍數(shù)達(dá)到7.24倍，極顯著高于其他各處理，而且不定芽長(zhǎng)勢(shì)好，芽苗健壯，葉色深綠。1 000 lx的不定芽增殖倍數(shù)為6.66倍，極顯著高于2 000 lx的增殖倍數(shù)，由此可見(jiàn)，煙葉唇柱苣苔不定芽的增殖不需要太強(qiáng)的光照，1 500 lx的光照強(qiáng)度最適宜不定芽的增殖與生長(zhǎng)。

（2）不同溫度對(duì)煙葉唇柱苣苔不定芽增殖的影響。由表4可知，在28 ℃溫度下培養(yǎng)40 d，煙葉唇柱苣苔不定芽的增殖倍數(shù)最高，達(dá)到7.09倍，其次是25 ℃，增殖倍數(shù)為6.28倍，最低的是31 ℃，只有3.93倍。方差分析結(jié)果表明，25 ℃和28 ℃的增殖倍數(shù)差異極不顯著，而二者與31 ℃的差異極為顯著。從生長(zhǎng)勢(shì)看，25 ℃和28 ℃溫度培養(yǎng)下，不定芽長(zhǎng)勢(shì)好，芽體健壯，31 ℃培養(yǎng)溫度芽苗長(zhǎng)勢(shì)差、芽細(xì)、有較多的枯葉。因此，煙葉唇柱苣苔不定芽增殖與生長(zhǎng)的適宜的溫度為25~28 ℃，最佳溫度為28 ℃。

2.3不定芽生根

（1）不同光照強(qiáng)度對(duì)煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表5可知，3種光照強(qiáng)度對(duì)煙葉唇柱苣苔生根數(shù)、株高和生長(zhǎng)勢(shì)的影響不明顯，三者之間的差異極不顯著；而對(duì)生根率則有一定的影響，1 000 lx和1 500 lx的生根率達(dá)到100.00%，二者與2 000 lx的生根率97.78%差異極顯著。因此，煙葉唇柱苣苔葉片不定芽生根的適宜光照強(qiáng)度為1 000~1 500 lx，最佳光照強(qiáng)度為1 500 lx。

（2）不同溫度對(duì)煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表6可知，28 ℃的誘根效果最好，煙葉唇柱苣苔生根率、生根數(shù)和株高分別為100.00%、18.92條、2.18 cm，與25 ℃的生根率和株高差異極不顯著，生根數(shù)的差異則達(dá)到極顯著水平；28 ℃與31 ℃的生根率、生根數(shù)和株高的差異，則達(dá)到極顯著水平。從生長(zhǎng)狀況看，在25~28 ℃的溫度下培養(yǎng)，植株健壯，葉色濃綠；31 ℃的培養(yǎng)溫度下，植株生長(zhǎng)勢(shì)差，細(xì)弱矮小，葉色枯黃。綜合試驗(yàn)結(jié)果，煙葉唇柱苣苔不定芽生根的最佳溫度為28 ℃。

3結(jié)論與討論

在植物的離體培養(yǎng)過(guò)程中，適宜的光照強(qiáng)度和溫度是培養(yǎng)中的細(xì)胞所必需的，其對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育影響很大。不同植物試管芽苗對(duì)光照強(qiáng)度有不同的反應(yīng)[3-4]。試驗(yàn)結(jié)果表明，1 000~1 500 lx的光照強(qiáng)度即可以滿(mǎn)足煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)需求，而各階段最適宜的光照強(qiáng)度有所不同，其中葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳光照強(qiáng)度為1 000 lx，不定芽增殖培養(yǎng)最佳光照強(qiáng)度為1 500 lx，1 000~1 500 lx的光照強(qiáng)度適宜不定芽的生根培養(yǎng)，二者的誘根效果差異極不顯著。本試驗(yàn)中，煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)其不定芽的誘導(dǎo)、增殖和生根最佳溫度均為28 ℃，在該溫度下，不定芽誘導(dǎo)率、芽的增殖倍數(shù)、生根率、平均生根條數(shù)及植株高度均為最高值，而且培養(yǎng)物的生長(zhǎng)勢(shì)最好[5-6]。

4參考文獻(xiàn)

[1] 李桭宇，王印波.中國(guó)苣苔科植物[M].北京：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2005：4-5.

[2] 湯正輝.苦苣苔科植物的快速繁殖、離體保存及耐陰性研究[D].成都：四川大學(xué)，2007.

[3] 王玉英，高新一.植物組織培養(yǎng)技術(shù)手冊(cè)[M].北京：金盾出版社，2006（37）：89-90.

[4] 溫放.廣西苦苣苔科觀賞植物資源調(diào)查與引種研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2008.

[5] 鄭曉珂，李軍，馮衛(wèi)生，等.苦苣苔科植物研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2003（4）：261-263.

[6] 呂惠珍，余麗瑩，黃寶優(yōu)，等.廣西苦苣苔科藥用植物資源[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2010（7）：6-10.

2.3不定芽生根

（1）不同光照強(qiáng)度對(duì)煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表5可知，3種光照強(qiáng)度對(duì)煙葉唇柱苣苔生根數(shù)、株高和生長(zhǎng)勢(shì)的影響不明顯，三者之間的差異極不顯著；而對(duì)生根率則有一定的影響，1 000 lx和1 500 lx的生根率達(dá)到100.00%，二者與2 000 lx的生根率97.78%差異極顯著。因此，煙葉唇柱苣苔葉片不定芽生根的適宜光照強(qiáng)度為1 000~1 500 lx，最佳光照強(qiáng)度為1 500 lx。

（2）不同溫度對(duì)煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表6可知，28 ℃的誘根效果最好，煙葉唇柱苣苔生根率、生根數(shù)和株高分別為100.00%、18.92條、2.18 cm，與25 ℃的生根率和株高差異極不顯著，生根數(shù)的差異則達(dá)到極顯著水平；28 ℃與31 ℃的生根率、生根數(shù)和株高的差異，則達(dá)到極顯著水平。從生長(zhǎng)狀況看，在25~28 ℃的溫度下培養(yǎng)，植株健壯，葉色濃綠；31 ℃的培養(yǎng)溫度下，植株生長(zhǎng)勢(shì)差，細(xì)弱矮小，葉色枯黃。綜合試驗(yàn)結(jié)果，煙葉唇柱苣苔不定芽生根的最佳溫度為28 ℃。

3結(jié)論與討論

在植物的離體培養(yǎng)過(guò)程中，適宜的光照強(qiáng)度和溫度是培養(yǎng)中的細(xì)胞所必需的，其對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育影響很大。不同植物試管芽苗對(duì)光照強(qiáng)度有不同的反應(yīng)[3-4]。試驗(yàn)結(jié)果表明，1 000~1 500 lx的光照強(qiáng)度即可以滿(mǎn)足煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)需求，而各階段最適宜的光照強(qiáng)度有所不同，其中葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳光照強(qiáng)度為1 000 lx，不定芽增殖培養(yǎng)最佳光照強(qiáng)度為1 500 lx，1 000~1 500 lx的光照強(qiáng)度適宜不定芽的生根培養(yǎng)，二者的誘根效果差異極不顯著。本試驗(yàn)中，煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)其不定芽的誘導(dǎo)、增殖和生根最佳溫度均為28 ℃，在該溫度下，不定芽誘導(dǎo)率、芽的增殖倍數(shù)、生根率、平均生根條數(shù)及植株高度均為最高值，而且培養(yǎng)物的生長(zhǎng)勢(shì)最好[5-6]。

4參考文獻(xiàn)

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[4] 溫放.廣西苦苣苔科觀賞植物資源調(diào)查與引種研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2008.

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[6] 呂惠珍，余麗瑩，黃寶優(yōu)，等.廣西苦苣苔科藥用植物資源[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2010（7）：6-10.

2.3不定芽生根

（1）不同光照強(qiáng)度對(duì)煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表5可知，3種光照強(qiáng)度對(duì)煙葉唇柱苣苔生根數(shù)、株高和生長(zhǎng)勢(shì)的影響不明顯，三者之間的差異極不顯著；而對(duì)生根率則有一定的影響，1 000 lx和1 500 lx的生根率達(dá)到100.00%，二者與2 000 lx的生根率97.78%差異極顯著。因此，煙葉唇柱苣苔葉片不定芽生根的適宜光照強(qiáng)度為1 000~1 500 lx，最佳光照強(qiáng)度為1 500 lx。

（2）不同溫度對(duì)煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表6可知，28 ℃的誘根效果最好，煙葉唇柱苣苔生根率、生根數(shù)和株高分別為100.00%、18.92條、2.18 cm，與25 ℃的生根率和株高差異極不顯著，生根數(shù)的差異則達(dá)到極顯著水平；28 ℃與31 ℃的生根率、生根數(shù)和株高的差異，則達(dá)到極顯著水平。從生長(zhǎng)狀況看，在25~28 ℃的溫度下培養(yǎng)，植株健壯，葉色濃綠；31 ℃的培養(yǎng)溫度下，植株生長(zhǎng)勢(shì)差，細(xì)弱矮小，葉色枯黃。綜合試驗(yàn)結(jié)果，煙葉唇柱苣苔不定芽生根的最佳溫度為28 ℃。

3結(jié)論與討論

在植物的離體培養(yǎng)過(guò)程中，適宜的光照強(qiáng)度和溫度是培養(yǎng)中的細(xì)胞所必需的，其對(duì)培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育影響很大。不同植物試管芽苗對(duì)光照強(qiáng)度有不同的反應(yīng)[3-4]。試驗(yàn)結(jié)果表明，1 000~1 500 lx的光照強(qiáng)度即可以滿(mǎn)足煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)需求，而各階段最適宜的光照強(qiáng)度有所不同，其中葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳光照強(qiáng)度為1 000 lx，不定芽增殖培養(yǎng)最佳光照強(qiáng)度為1 500 lx，1 000~1 500 lx的光照強(qiáng)度適宜不定芽的生根培養(yǎng)，二者的誘根效果差異極不顯著。本試驗(yàn)中，煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)其不定芽的誘導(dǎo)、增殖和生根最佳溫度均為28 ℃，在該溫度下，不定芽誘導(dǎo)率、芽的增殖倍數(shù)、生根率、平均生根條數(shù)及植株高度均為最高值，而且培養(yǎng)物的生長(zhǎng)勢(shì)最好[5-6]。

4參考文獻(xiàn)

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