基于氨芐青霉素的抗污染根瘤菌劑制備技術

李劍峰等

摘 要 以微波輻照誘變獲得的紅豆草根瘤菌和苜蓿根瘤菌耐氨芐青霉素突變株為供試菌株，發酵培養至菌液活菌量達1×1010 cfu/mL時加氨芐青霉素至終濃度為200 mg/L，以該菌液制備液體抗污染菌劑或添加到滅菌泥炭中制成固體防污染菌劑。結果表明：菌劑中菌株生長正常，菌株繁殖速度與無抗生素菌劑無顯著差異，加入滅菌泥炭制成的防污染菌劑儲藏120 d后的雜菌率僅為市面上購得的普通根瘤菌劑雜菌率的11.89%～4.7%。表明該菌劑制備技術具有設備簡單、成本低廉、活菌數高、雜菌率低的特點，能有效提高根瘤菌劑質量。

關鍵詞 氨芐青霉素；抗污染根瘤菌劑；制備技術

中圖分類號：S144.9 文獻標志碼：A文章編號：1673-890X（2014）21--02

目前，根瘤菌劑已廣泛應用于豆科作物及牧草栽培生產中，增產幅度可達10%～30%，用于新墾或低產田的增產效果更達71.2%～241%[1]。由于制備成本低，用量少，無毒害，無污染和增產明顯，根瘤菌劑的生產規模逐漸擴大，并發展了一些新的品種和劑型。目前，根瘤菌劑產品面臨的主要問題有：（1）高污染率。菌劑中有適宜包括環境雜菌在內的多種微生物繁衍的養分條件。在產品制備運輸過程中，微小破損也極易造成雜菌侵入引起菌劑嚴重污染，施用后不能發揮增產效應甚至造成減產[2]，造成廠家和菌劑使用者嚴重的經濟損失。目前，根瘤菌劑面臨著8%～32%的高污染率。尋求降低污染率的方法成為菌劑生產中的核心問題。（2）目標菌種與土著根瘤菌間的競爭。土著根瘤菌已適應了原生土壤環境，競爭力強，新施入的目標根瘤菌很難形成優勢群落，因此占瘤率低下，高效根瘤比例少，增產作用受限。提高目標菌株在土壤環境中的競爭力也是菌劑研發人員關注的重點問題；由此，擬探討以優良根瘤菌的耐藥突變株，結合適當濃度的氨芐青霉素制備抗污染菌劑解決上述問題的可能性，為根瘤菌劑的研究應用提供新的方法。

1 利用抗生素和耐藥菌株制作抗污染根瘤菌劑的方法

利用微波輻照（約800 W，1 min）處理紅豆根瘤菌和苜蓿根瘤菌后，在含氨芐青霉素的選擇培養基上篩選，并進行宿主植物回接實驗。獲得固氮酶及結瘤能力不弱于原始菌株，在含300 mg/L氨芐青霉素的環境中生長良好的紅豆草根瘤菌耐青霉素突變株RSW96[3]和苜蓿根瘤菌耐青霉素突變株LW107[4]。

取2種菌株活菌含量達到1×1010 cfu/mL的部分發酵菌液中緩慢加入氨芐青霉素并逐漸攪拌，使菌液中氨芐青霉素終濃度達到200 mg/mL，將此菌液加入磷酸緩沖液后制成液體菌劑在15～4 ℃下保存，或將該菌液添加入滅菌草炭后制成抗污染菌劑[5]；另取部分培養菌液加入800 mg/mL的氨芐青霉素，參照上文制成含高濃度抗生素的試樣，與含200 mg/mL氨芐青霉素的菌劑同條件下儲藏；再取部分培養菌液制成無抗生素的普通菌劑。對各試樣儲存65 d后進行活菌數、雜菌數的測定；對菌劑進行宿主回接實驗測定目標菌株占瘤率[5]。

2 菌劑測定結果

2.1 菌劑污染率

在高雜菌污染環境下放置90 d后，普通固體菌劑的平均雜菌含量為2.27×108 cfu/g，雜菌率達19.53%，而含200 mg/L氨芐青霉素的防污染固體菌劑平均雜菌率僅為0.3%～1.7%，雜菌中真菌和細菌的含量比普通菌劑分別降低14.5倍和11.12倍，能夠有效降低雜菌的污染[4]。

2.2 菌劑有效活菌數

紅豆草和苜蓿抗污染固體根瘤菌劑在保存65 d后活菌含量分別達到6.26×109 cfu/g和2.11×1010 cfu/g，分別是其普通固體菌劑活菌含量的302.41%和418.65%，差異極顯著（P<0.01）[3]。

2.3 抑制土著根瘤菌，提高占瘤率

通過抗藥平板檢測法對使用普通菌劑和抗藥菌劑處理苜蓿（紅豆草）植株上的根瘤進行檢測，普通菌劑目標菌的平均占瘤率為58.07%（紅豆草）和73.12%（苜蓿），而抗污染菌劑處理的植株，目標菌的占瘤率為68.67%和89.33%，差異顯著（P<0.05）。

3 優點

3.1 適宜規模推廣和應用

該技術可直接利用現有常規菌劑的生產設備和發酵工藝，菌株的誘變方法簡便易行，抗生素和泥炭等原料易于購置。降低了企業的技術改造和生產成本。

3.2 降低菌劑的污染率，提高活菌數

由于菌劑中含有廣譜抗菌物質，菌劑在生產運輸中即使接觸到少量雜菌也不會引起嚴重污染。貯藏過程中，隨著菌劑水分的散失，抑菌劑的濃度略增，對菌株會有微弱的代謝抑制，可促使菌株快速進入休眠，減少菌種在儲存過程中因過量繁殖、營養耗盡引起菌體大量死亡[4]。

3.3 抑制土著根瘤菌，提高占瘤率

菌劑施用后，盡管抑菌劑稀釋后濃度降低，但仍對土著根瘤菌有抑制，會為目的菌株創造利于競爭結瘤的環境，使占瘤率增大，菌劑肥效作用更為明顯。

3.4 抑制土壤群落中的有害菌，減少農藥使用量

氨芐青霉素會抑制土壤中的諸多病原菌。根瘤菌劑多用于拌種和苗期使用，菌劑中抗生素的降解過程與植物的生長過程同步，在降解完成、藥效失去作用之前，可為幼苗期植株根系提供保護，減少農藥的使用量，降低了土壤的農藥污染。

3.5 降低菌劑生產過程對無菌環境的要求

該技術能夠降低菌劑生產過程中對無菌環境的嚴格要求，菌劑生產廠家在設備和廠房上無需增加投入，在保證品質的前提下降低了菌劑的生產成本。

3.6 使用簡便，易于掌握

該技術原理簡單易于理解，涉及的菌種篩選方法在科研和生產中已比較成熟，便于學習和操作，能夠適應不同的生產和研發環境。適宜于大范圍的推廣和應用。

4 與其他根瘤菌劑制備相關技術的區別

目前，嚴格控制生產和存儲環境凈度，嚴密封裝，菌劑低營養化，凍干及固定化包埋菌種等方法均取得了良好的效果，但或者對生產設備和工藝有一定要求，不利于降低成本，或者可能以損失大量的活菌，以降低菌肥品質為代價降低污染。難以被中小菌劑廠家接受。而該技術利用常規菌株育種手段，不改變現有菌劑生產的設備和封裝條件，不涉及昂貴的儀器和復雜的技術，原料易購易得，工藝簡單，低成本，高收益，便于推廣[4]。

另外，目前多以基因工程手段提高菌株結瘤因子的表達強度來提高目的菌株的結瘤競爭力。但根瘤菌互接種族種類繁多，作物生境多樣，難以就每種作物在各具體生境下進行基因改良。該技術能抑制作物根際土著根瘤菌的繁殖，使有抗性的目的菌在時間和空間上獲得優勢。不同于轉基因技術構建的工程菌，誘變篩選得到的抗性菌株不存在轉基因菌株的生態風險，使用的抑菌劑為氨芐青霉素，屬于可降解物質，無污染，高效安全。但在施用時，菌劑需要稀釋以控制合理的抗生素釋放濃度，降低生物安全風險[4]。

參考文獻

[1]?，|，王煒，屈新蘭. 苜蓿根瘤菌菌劑的研究[J]. 新疆農業科學，2004，41（2）： 103-104.

[2]Lupwayi NZ，Olsen PE，Sande ES，et al. Inoculant quality and its evaluation [J]. Field Crops Research，2000，65： 259-270.

[3]李劍峰，張淑卿，師尚禮.微波誘變選育高產生長素及耐藥性根瘤菌株研究[J]. 核農學報，2009，（6）：981-985.

[4]李劍峰. 解磷根瘤菌誘變選育及抗污染菌劑制備關鍵技術研究[D].甘肅農業大學，2011，97-112.

[5]師尚禮，李劍峰，曹文俠，等. 一種抗污染根瘤菌劑及其制作方法： 中國，CN101935238A[P]. 2009-07-02.

（責任編輯：劉昀）endprint