腸道微生物對牛蒡苷的轉化及轉化酶的初步研究△

姜洪帥，竇德強

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

研究開發

腸道微生物對牛蒡苷的轉化及轉化酶的初步研究△

姜洪帥，竇德強*

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600)

目的：研究人腸內細菌對牛蒡苷48 h的轉化和轉化酶的性質。方法：采用人腸內細菌的混合菌液與牛蒡苷在37 ℃厭氧條件下進行培養；采用硅膠柱色譜和制備HPLC分離轉化產物；根據核磁共振波譜鑒定轉化產物的結構；采用超聲破碎方法，提取人腸內細菌總酶。結果：牛蒡苷在48 h內可被人腸內細菌轉化為牛蒡苷元和牛蒡苷元脫甲基化產物；轉化酶可能為組成酶和誘導酶。結論：牛蒡苷在48 h時主要轉化產物為牛蒡苷元和脫甲基化產物。

牛蒡苷；人腸內細菌；生物轉化；酶

中藥主要以傳統水煎液口服的方式使用，因此中藥有效成分的轉化吸收和代謝主要發生在胃腸道和肝臟。人體的消化道中寄居著100多種微生物，數量一般為1012～1014個，微生物的種群和數量影響著人體的健康，有學者將腸道內具有調控代謝和化學轉化能力的微生物群落作為人體的一個新器官[1]。微生物在體內寄居時，產生和分泌多種酶類，在維持微生物自身新陳代謝的同時，對經過胃腸道的食物和藥物進行酶催化性生物轉化，進而幫助攝入食物和藥物的轉化和吸收。酶催化的化學反應具有效率高、區域選擇性和立體選擇性強、副產物少、反應條件溫和等特點[2]。牛蒡子作為傳統中藥被廣泛使用，牛蒡苷為其主要的木脂素類成分，目前報道牛蒡苷藥理作用的文獻不多，而牛蒡苷元作為其水解產物具有多方面牛蒡苷所沒有的藥理作用，甚至在某些方面藥理作用比牛蒡苷更強[3]。Li等利用人和鼠的腸道微生物在體外厭氧轉化的方法，發現牛蒡苷通過水解、脫甲基、脫羥基的過程，經過7 d最終轉化為動物木脂素腸內酯[4]。然而口服的藥物，在胃腸道中消化和吸收的時間最長為72 h，一般在體內停留時間為48 h，因此在體外研究胃腸道微生物對藥物的轉化試驗中，一般考察微生物對藥物的48 h轉化，延長微生物對藥物在體外的轉化時間，只有微生物在體外轉化意義而沒有藥物在體內胃腸道中的微生物轉化意義[5]。因此本實驗通過考察48 h內牛蒡苷在體外的轉化情況，來推測牛蒡苷在體內胃腸道的代謝情況，為尋找牛蒡苷在體內發揮藥效的真正活性成分奠定基礎。

1 儀器與試藥

牛蒡苷(實驗室自制，純度≥98%)；厭氧液體培養基(北京陸橋技術有限責任公司)；甲醇(天津市登科化學試劑有限公司)；三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司)；正丁醇(天津市進豐化工有限公司)；甲醇(美國TE-DIA公司)。

Agilent 1260型高效液相色譜系統(美國安捷倫Agilent科技公司)；HPP-9272電熱恒溫培養箱(北京東聯哈爾儀器制造公司)；DL-CJ-1N型垂直層流單人標準操作臺；MLS-3780高壓蒸氣滅菌鍋(杭州亞旭生物科技有限公司)；KQ-250DE臺式數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 人腸內細菌對牛蒡苷的轉化及產物的分離和鑒定

2.1.1 人腸內混合菌液的制備 收集脾胃功能正常的健康志愿者排出的新鮮糞便(3個月內沒有服用過抗菌藥)，裝入反復多次充滿氮氣的自封袋內，加入重量與體積比為1∶1的已滅菌的厭氧肉湯培養基，用手擠壓，使糞便均勻化，孔徑為1 mm紗布過濾，得到人腸內細菌的混合液。

2.1.2 牛蒡苷在混合菌液中的轉化 吸取上述混合菌液體積的1/10，加入10倍量的培養基和50 mg的牛蒡苷，放入保干器內，通過燭缸法和焦性沒食子酸化學吸氧法除去容器中的氧氣，當厭氧指示劑試紙顯示白色后表明達到厭氧狀態。將保干器放入恒溫培養箱內，在37 ℃下厭氧培養48 h。

2.1.3 轉化產物的分離和鑒定 向48 h的轉化液中加入等體積的正丁醇(水飽和，0.1%乙酸酸化)，搖勻，4 000 r·min-1離心30 min，分層，反復萃取離心3次，合并正丁醇層，旋轉蒸干，硅膠柱色譜CHCl3-CH3OH(100∶0→100∶1)梯度洗脫，制備HPLC純化，得到化合物2和3。

化合物2：無色針狀結晶，通過HPLC圖和TLC法與牛蒡苷元對照品比較，確定化合物2為牛蒡苷元。

化合物3：棕色粉末狀固體，13C-NMR(CDCl3，500 MHz)：179.5(C-1)，46.5(C-2)，41.0(C-3)，71.6(C-4)，130.6(C-1′)，116.2(C-2′)，144.0(C-3′)，142.9(C-4′)，115.3(C-5′)，121.6(C-6′)，34.2(C-7′)，130.6(C-1")，112.0(C-2")，149.1(C-3")，147.9(C-4")，111.5(C-5")，120.8(C-6")，38.2(C-7")，56.0，55.9(-CH3×2)。通過與文獻[4]數據比較，確定化合物3為牛蒡苷元脫甲基產物。

根據化合物2和3的結構，推斷牛蒡苷的轉化路徑如圖1所示。

采用HPLC監測牛蒡苷的轉化過程，色譜柱為Agilent ZORBAX-SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(46∶54)，檢測波長為280 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃。牛蒡苷轉化的HPLC圖見圖2。

圖1 人腸內細菌對牛蒡苷的生物轉化路徑

1.牛蒡苷 2.牛蒡苷元 3.3″-去甲基牛蒡苷元A.糞便空白溶液 B.牛蒡苷起始轉化溶液 C.牛蒡苷48 h轉化溶液圖2 牛蒡苷轉化的HPLC圖

2.2 人腸內微生物粗酶的提取及對牛蒡苷的轉化

取40 g新鮮糞便，按照質量與體積比為1∶5加入4 ℃、pH 7.2的緩沖溶液，孔徑為1 mm的紗布過濾，制備糞便混懸液。取50 mL濾液在冰浴條件下，200 W超聲破碎細胞，超聲3 s，停3 s，在4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min，收集上清液，作為總酶。向總酶溶液中加入50 mg的牛蒡苷，置于37 ℃下轉化48 h。另取50 mL糞便混合液，加入50 mg的牛蒡苷，在37 ℃厭氧條件下轉化48 h，作為與總酶轉化的對照。分別取48 h的總酶轉化液和糞便混合液的轉化液萃取離心、點板，三氯化鐵試劑顯色。結果表明總酶轉化液只有1種轉化產物，為牛蒡苷元；糞便混合液存在兩種轉化產物，分別為牛蒡苷元和牛蒡苷元脫甲基化產物。

3 討論

通過牛蒡苷在體外的48 h轉化實驗，發現牛蒡苷可以全部轉化成牛蒡苷元，而牛蒡苷元有部分轉化為化合物3，這與存在的轉化酶的性質有一定的聯系。在總酶提取液中，可以使牛蒡苷水解為牛蒡苷元，說明水解酶可能是一種人體胃腸道分泌的消化酶，也可能是微生物體內的一種組成酶，而在微生物超聲破碎以后，微生物死亡，總酶釋放到溶液中，而總酶并不能對牛蒡苷元進行轉化，由此可以說明脫甲基酶是微生物的一種誘導酶，需要底物牛蒡苷元誘導一段時間后活體微生物才會產生，進而催化轉化的進行。從48 h的結果分析，牛蒡苷轉化成牛蒡苷元非常完全，牛蒡苷元脫甲基轉化不完全，說明脫甲基過程是控制轉化的限速步驟。牛蒡苷在體內發揮藥效的物質基礎可能是牛蒡苷元和牛蒡苷元脫甲基化轉化產物。

[1] 劉開朗，王佳啟，卜登攀，等.人體腸道微生物多樣性和功能研究進展[J].生態學報，2009，30(5)：2589-2594.

[2] Ma B P，Feng B，Huang H Z，et al.Biotransformation of Chinese herbs and their ingredients[J].Mode Tradit Chin Med Mater Med，2010，12(2)：150-154.

[3] 王潞，趙烽，劉珂.牛蒡子苷及牛蒡子苷元的藥理作用研究進展[J].中草藥，2008，39(3)：467-470.

[4] Xie L H，Ahn E M，Akao T，et al.Transformation of arctiin to estrogenic and antiestrogenic substances by human intestinal bacteria[J].Chem Pharm Bull，2003，51(4)：378-384.

[5] 楊秀偉，徐嵬.中藥化學成分的人腸內細菌生物轉化模型和標準操作規程的建立[J].中國中藥雜志，2011，36(1)：19-26.

The Biotransformation of Arctiin by Human Intestinal Bacteria and Enzymes

JIANG Hongshuai，DOU Deqiang*

(CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China)

Objective：To study the biotransformation of arctiin by human intestinal flora(HIF)within 48 h and the characteristics of transformation enzymes.Methods：The arctiin was anaerobically incubated with HIF at 37 ℃ for 48 h.The biotransformation products were isolated and purified by silica gel column chromatography and prepared HPLC.Chemical structures of the transformed products were determined by nuclear magnetic resonance(NMR)method.The enzymes of HIF were extracted by ultrasonication.Results：Arctiin was converted to arctigenin and 3″-demethylarctigenin.Its transform enzymes were probably constitutive enzymes and induced enzymes.Conclusion：The main biotransformation products of arctiin were arctigenin and 3″-demethylarctigenin within 48 h.

Arctiin；Human intestinal bacteria；Biotransformation；Enzyme

沈陽市科學計劃項目(F11-264-1-20)；遼寧省高等學校創新團隊項目(LT2013020)

*[通信作者] 竇德強，教授，博士生導師，研究方向：中藥藥效(性)物質基礎及新藥開發研究；Tel：(0411)87406497，E-mail：deqiangdou@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.01.003

2013-09-13)