腺病毒介導miRNA－138抑制人胃癌BGC－823細胞增殖的機制研究＊

范亞川，梁光萍，陳先華，胡春燕，鄒利全，李學成，陳 陵△

（1.中國人民解放軍三二四醫院消化內科，重慶400020；2.第三軍醫大學西南醫院燒傷研究所，重慶400038；3.第三軍醫大學新橋醫院腫瘤生物治療中心，重慶400037）

胃癌是全球腫瘤中發病率、致死率最高的腫瘤之一，傳統手術、化療及放療療效欠佳［1］，5年生存率不到30%［2］，因此需要深入研究胃癌發病機制并開發新的治療模式［3］。隨著miRNA（miR）的功能的揭示，miRNA 在腫瘤早期診斷［4］及治療［5］中的作用日益受到重視。筆者在前期研究中發現，miR－138在胃癌進展過程中呈逐步下降趨勢，且其表達與hTERT呈負相關［6］，而hTERT 可促進胃癌發生、發展［7－8］。國外有研究亦發現，miR－138可通過抑制甲狀腺癌內hTERT蛋白表達而抑制甲狀腺癌細胞生長［9］。在成功包裝負載miR－138的腺病毒［10］基礎上，本研究擬進一步探討miR－138過表達對人胃癌BGC－823細胞增殖及侵襲能力的影響及可能的作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人胃癌BGC－823細胞株（中科院上海生科院細胞資源中心），DMEM高糖培養基、胎牛血清（FBS）及胰蛋白酶（HyClone），負載有miR－138表達序列的復制缺陷型腺病毒（Ad－miR138），由本室構建并保存［10］；負載有β－半乳糖苷酶（β－gal）基因LacZ的復制缺陷型腺病毒，由西南醫院心內科唐兵博士惠贈。mirVanaTMmiRNA提取試劑盒（Ambion），逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa）；ABI7500熒光定量PCR儀（ABI）；CCK－8檢測試劑盒（碧云天）；Transwell小室（Corning）。

1.2 方法

1.2.1 BGC－823細胞培養 采用含10%FBS的高糖DMEM培養液，置37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 Ad－miR138感染人胃癌細胞BGC－823 取對數生長期的BGC－823細胞接種于6孔細胞培養板中，以PBS代替腺病毒作為空白對照（BGC－823組）；感染 Ad－LacZ的陰性對照（BGC823－AdLacZ組）；感染 Ad－miR138的BGC823－AdmiR138組。腺病毒感染步驟參照文獻［10］進行。感染后48h收集各組細胞用于后續實驗。

1.2.3 實時定量－聚合酶鏈反應（RT－PCR）檢測miR－138表達提取細胞miRNA，逆轉錄cDNA，配好RT－PCR反應體系后，于ABI7500熒光定量PCR儀上進行PCR反應，退火溫度為60℃。相對定量采用2－△△CT進行計算，引物序列見表1。

1.2.4 CCK－8方法檢測胃癌細胞增殖 感染腺病毒48h后收集各組細胞，以每孔2.5×103個細胞，接種于96孔板中，共檢測6次，每天1次，每個時間點設置3個復孔。檢測前每孔分別加入20μL CCK－8試劑，避光37℃孵育2h，輕輕振蕩后，酶標儀測定450nm波長處吸光度（A）值，并比較各組細胞的A值，觀察miR－138對胃癌細胞增殖的影響并計算抑瘤率。抑瘤率＝（1－實驗組A值／對照組A值）×100%。

表1 RT－PCR及PCR引物列表

1.2.5 Transwell小室檢測胃癌細胞侵襲能力 感染腺病毒48h后收集各組細胞，用無血清的DMEM培養液懸浮細胞，稀釋成1×105mL－1的細胞密度，加入200μL細胞懸液至Transwell上室，下室加入800μL的含10%血清的DMEM培養液，37℃孵育24h后，乙醇棉球拭去上室未遷移細胞，經95%乙醇固定后，1%結晶紫染色3min。采用顯微鏡觀察細胞遷移情況，實驗重復3次。隨機取5個200倍視野，計數侵襲的細胞，取平均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RT－PCR 檢測 Ad－miR138感染 BGC－823細胞后 miR－138的表達 與BGC823－AdLacZ組相比，BGC823－AdmiR138組細胞內miR－138表達豐度顯著上調（1.07±0.07 vs.4.89±0.45），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 CCK－8檢測細胞生長曲線 采用CCK－8檢測細胞生長曲線。與對照組相比，BGC823－AdmiR138組細胞增殖受到明顯抑制。在第5、6天，BGC823－AdmiR138組A值顯著低于對照組（5d：0.41±0.04 vs.0.65±0.08；6d：0.52±0.06 vs.0.77±0.06），第5、6天抑瘤率分別為36.9%、32.5%。

2.3 Ad－miR138感染對胃癌BGC－823細胞侵襲能力的影響與BGC823－AdLacZ組相比，Ad－miR138實驗組細胞侵襲能力顯著下降（56±12 vs.32±11），差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 CCK－8檢測BGC－823細胞生長曲線

圖2 Transwell小室檢測胃癌細胞侵襲能力

3 討 論

新近研究發現，miR－138是一重要的抑癌miRNA，可通過靶向多個癌基因抑制腫瘤生長，例如在肝癌細胞株內miR－138功能模擬物可抑制靶基因CCND3而在體外及小鼠體內抑制肝細胞癌的生長與轉移［11］。miR－138還可通過 BCR－ABL／GATA1／miR－138環路，抑制慢性髓樣白血病細胞株增殖，促進其凋亡［12］。還有研究發現，在腎透明細胞癌細胞株786－0內，miR－138可抑制靶基因HIF－1α表達而促進腎癌細胞凋亡并抑制其侵襲能力［13］；并且，miR－138還可通過抑制其靶基因P－糖蛋白，Bcl－2以及多種耐藥基因－1，逆轉白血病細胞株 HL－60的耐藥性［14］。這些結果表明，miR－138是一個重要的抑癌miRNA。筆者前期研究亦發現，轉染 miR－138功能模擬物RNA后，人胃腺癌細胞株SGC－7901增殖能力顯著抑制［15］。由于miR－138功能模擬物RNA易降解，作用時間短。

本研究采用Ad－miR138感染人胃癌BGC－823細胞株，發現Ad－miR138可明顯上調細胞內miR－138表達豐度，并顯著抑制BGC－823細胞的增殖及侵襲能力。因此，以抑癌miR－138作為胃癌治療靶標的策略是可行的。并且，由于miR－138可通過多種機制抑制腫瘤生長與增殖，并可逆轉腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性［14］，因此極可能成為優良的抗腫瘤治療靶標。

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