兩種大鼠皮瓣缺血再灌注損傷模型的比較

劉蘊琦　劉藝芳　肖一丁　張明子　王曉月　馬雪梅　王友彬

[摘要] 目的 比較大鼠腹部與背部缺血再灌注損傷（IRI）模型的差異，探討更為合適的動物皮瓣IRI模型。 方法 選用健康SD雄性大鼠24只，隨機分成4組，每組各6只，分別為腹部皮瓣缺血再灌注（aIR）組，腹部皮瓣假手術（aSH）組，背部皮瓣缺血再灌注（dIR）組及背部皮瓣假手術（dSH）組。腹部皮瓣以腹壁下淺動脈為蒂，背部皮瓣以髂腰淺動脈為蒂。術后5 d，觀察大鼠死亡及皮瓣啃食損壞率，應用激光多普勒血流灌注成像儀計算成活區域平均血流灌注量及皮瓣成活率，HE染色進行組織形態學觀察，TUNEL染色檢測皮瓣組織細胞的早期凋亡，計算凋亡細胞陽性指數（AI）。 結果 dIR組死亡率（0.0%）、皮瓣啃食損壞率（0.0%）低于aIR組的16.7%與50.0%，差異有統計學意義（P < 0.05），且dIR組炎性浸潤情況弱于aIR組。aSH組與dSH組的皮瓣成活率[（59.90±8.94）%、（97.63±1.29）%]及成活區域平均血流灌注量[（125.54±14.52）、（149.38±13.69）PU]分別高于aIR組與dIR組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。aSH組與dSH組AI[（13.48±5.23）%、（6.70±3.97）%]分別低于aIR組與dIR組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。dIR組皮瓣成活率[（53.30±5.40）%]、成活區域平均血流灌注量[（100.46±15.93）PU]較aIR組[（30.77±11.53）%、（39.45±9.94）PU]高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。dIR組AI[（43.72±6.15）%]較aIR組[（57.78±17.38）%]低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。 結論 背部皮瓣缺血再灌注損傷模型是較腹部皮瓣更為理想的模型。

[關鍵詞] 缺血再灌注損傷；動物模型；大鼠；皮瓣

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（a）-0009-04

臨床上，應用皮瓣進行組織修復和器官再造時，常會發生皮瓣缺血再灌注損傷。較長時間皮瓣缺血可引起缺血損傷，恢復血流灌注后，皮瓣的組織損傷會進一步加重[1]，從而導致皮瓣部分或完全壞死，影響手術成功率，因此，研究減輕皮瓣缺血再灌注損傷的方法具有重要的臨床意義。皮瓣缺血再灌注損傷研究的動物模型主要有豬、家兔和鼠類皮瓣模型等，其中又以大鼠皮瓣模型最為常用[2]。既往經典的大鼠皮瓣缺血再灌注模型為腹部島狀皮瓣模型，此種模型在研究高壓氧[3]和干細胞處理[4]等方法對皮瓣缺血再灌注損傷的治療效果上取得了一定研究成果。但腹部皮膚常被大鼠啃食損壞，組織結構完整性差，且感染情況嚴重，實驗結果穩定性差。利用背部皮膚建立皮瓣缺血再灌注損傷模型成為研究皮瓣缺血再灌注損傷的新方法。本實驗旨在比較兩種模型的優劣。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組

選用體重280～350 g，健康雄性SD大鼠24只，隨機分成4組，每組各6只，分別為腹部皮瓣缺血再灌注（abdominal skin flap ischemia reperfusion，aIR）組：顯微血管夾夾閉右側腹壁下淺血管，阻斷供血6 h；腹部假手術（abdominal skin flap sham operation，aSH）組：不進行缺血處理；背部皮瓣缺血再灌注（dorsal skin flap ischemia reperfusion，dIR）組：顯微血管夾夾閉左側髂腰淺動脈，阻斷供血6 h；背部假手術（dorsal skin flap sham operation，dSH）組：不進行缺血處理。動物購于北京華阜生物科技股份有限公司，喂養于20～25℃的環境中，術前術后均采用自由喂食和飲水。本實驗遵循國際動物委員會的相關規定并經北京協和醫院動物倫理委員會批準。

1.2 模型制備

1.2.1 腹部皮瓣模型制備 10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，參照Küntscher等[5]的類似實驗設計，將大鼠腹部剃毛，以腹中線為對稱軸設計寬6 cm、長9 cm的皮瓣。術區消毒鋪巾后，將皮瓣沿設計線切開，顯露雙側腹壁下淺血管后，結扎并切斷左側動脈，形成以右側腹壁下淺血管為蒂的腹部皮瓣，顯微血管夾阻斷供血6 h[6]，恢復皮瓣血供后將皮瓣原位縫合，皮瓣下置相應大小的硅橡膠片。腹部假手術組大鼠不進行缺血操作。

1.2.2 背部皮瓣模型制備 大鼠經10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，固定后備皮，以背部中線為對稱軸設計寬6 cm、長9 cm的皮瓣。術區消毒鋪巾后，將皮瓣沿設計線切開，暴露出血管，結扎右側髂腰、雙側胸背淺動脈，以左側髂腰淺動脈為蒂，充分游離皮瓣，顯微血管夾阻斷供血6 h，恢復皮瓣血供后將皮瓣原位縫合，皮瓣下置相應大小的硅橡膠片。背部假手術組大鼠不進行缺血操作。

1.3 動物存活率與皮瓣完整性觀察

術后觀察各組動物的存活和皮瓣的啃食損壞狀況。由于自身啃食造成皮瓣部分缺失的視為皮瓣被啃食損壞。

1.4 皮瓣微循環檢測

激光多普勒可直接觀察皮瓣中的血流情況，監測皮瓣的微循環，區分壞死和成活區域。術后第5天，將大鼠麻醉后，用激光多普勒血流灌注成像儀（LDF，PeriScan PIM3，Perimed AB，Sweden）觀測皮瓣血流情況。方法：將激光探頭置于皮瓣區上部，設定相應的觀測范圍，包含皮瓣及周圍正常皮膚。對設定區域的皮膚血流灌注量進行測量后，LDF自動報告測定范圍內不同部位皮膚血流量數據及不同顏色圖像。紅色代表皮瓣血流灌注量最大，黑色代表最小甚至沒有血流灌注，黃色和藍色介于二者之間。圖像顏色和皮瓣成活情況的關系是，紅色、黃色以及與三者相連的藍色區域視為皮瓣成活區，黑色視為皮瓣壞死區，藍黑交界處視為皮瓣成活與壞死分界線。根據該分界線用移動鼠標在圖像上人工標定皮瓣成活區（即紅、黃和相鄰部分藍色區域），其面積值由與LDF配套連接的計算機自動計算生成并依此計算出皮瓣成活率。皮瓣成活率=（成活區域面積/皮瓣總面積）×100%。endprint

1.5 HE染色觀察

于皮瓣蒂部的近端部位取1 cm2大小組織塊，中性福爾馬林緩沖液固定，石蠟包埋，制作切片，脫蠟水化，蘇木精（中杉金橋，5 mL）5 min，1%鹽酸酒精分化，伊紅（中杉金橋，100 mL）5 min，自來水返藍10 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。觀察皮膚的組織學變化。

1.6 凋亡檢測

末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d-UTP缺口末端標記技術（TUNEL）標記凋亡細胞：皮瓣組織切片脫蠟水化，置細胞通透液室溫8 min，加入TUNEL反應混合液（Roche，Switzerland，50Tests），37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，加入Converter-POD，37℃孵育30 min，PBS清洗，DAB（中杉金橋，10 mL）染色，蘇木精復染，封片鏡檢。在病變典型處連續計數5個高倍視野（400×），每視野記數300個細胞中陽性細胞數，計數凋亡細胞數目及總細胞數目，以陽性細胞數所占總細胞數的百分比作為凋亡細胞陽性指數（AI），AI=（凋亡細胞數目/總細胞數目）×100%。

1.7 統計學方法

實驗數據采用SPSS l7.0軟件進行統計學分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物存活率與皮瓣完整性

假手術組均未見死亡。術后第2天aIR組死亡1只，死亡率為16.7%，dIR組未見死亡，死亡率為0.0%。術后5 d，aIR組皮瓣啃食損壞率為50.0%，dIR組為0.0%，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.2 皮瓣微循環檢測

術后5 d，成活皮瓣質地柔軟、顏色新鮮，壞死區域干癟，顏色呈深棕或黑色。LDF掃描圖像，壞死區域顏色為黑色（圖1，封三）。根據LDF測出各組的成活區域平均血流灌注量，aSH組皮瓣成活率[（59.90±8.94）%]、成活區域平均血流灌注量[（125.54±14.52）PU]及dSH組皮瓣成活率[（97.63±1.29）%]、成活區域平均血流灌注量[（149.38±13.69）PU]分別高于aIR組與dIR組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。dIR組皮瓣成活率為（53.30±5.40）%，成活區域平均血流灌注量為（100.46±15.93）PU，高于aIR組的（30.77±11.53）%和（39.45±9.94）PU，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。

2.3 HE染色觀察

利用HE染色分析組織的炎性浸潤情況（圖2，封三），aIR組皮瓣組織內大量炎癥細胞聚集，炎癥細胞胞核被染成藍色，多于dIR組，aSH組與dSH組皮瓣組織內基本未見炎癥細胞聚集。

2.4 凋亡檢測

凋亡染色完成后用顯微鏡觀察染色情況（圖3，封三），觀察結果顯示：aIR組與dIR組，TUNEL染色主要位于基底層細胞的核上，呈顏色深淺不一的棕色凋亡細胞。aSH組AI[（13.48±5.24）%]與dSH組AI[（6.70±3.97）%]分別低于aIR組[（57.78±17.38）%]與dIR組[（43.72±6.15）%]，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。dIR組AI低于aIR組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。同時dIR組凋亡細胞染色程度較aIR組明顯降低。aSH組與dSH組由于未進行缺血處理，未見明顯凋亡細胞。

3 討論

腫瘤切除及各種創傷常會造成體表組織器官的缺損，皮瓣移植是修復這類缺損的主要方法[7-8]。皮瓣部分或全部壞死將導致手術的失敗，皮瓣壞死主要的原因是持續性皮瓣缺血或暫時缺血以及其后的缺血再灌注損傷。大鼠腹部皮瓣缺血再灌注模型能引起較單純缺血，并且能直觀地顯示損傷程度，因此廣泛地運用于皮瓣缺血再灌注損傷方面的研究[9]。但在實際造模中發現，腹部模型大鼠死亡率、皮瓣啃食損壞率高，血流恢復緩慢，皮瓣成活率及凋亡指數不穩定，導致造模效率低。

本實驗中，假手術組皮瓣成活率及成活區域平均血流灌注量顯著高于各自的缺血再灌注組，凋亡指數也顯著低于缺血再灌注組，這表明各組模型的建立是成功的。大鼠存活過程中，腹部皮瓣與墊料長時間頻繁接觸，傷口受外界感染概率大且濕度較高，因存在個體差異，實驗組內個體的炎性反應差別大，對研究皮瓣缺血再灌注損傷引發的無菌性炎癥以及所表達的炎癥因子的定量研究影響較大[10]，對凋亡因子的研究也有較大影響，同時還造成aIR組AI[（57.78±17.38）%]較dIR組[（43.72±6.15）%]穩定性差。在傷口愈合及皮瓣壞死過程中，局部不適感可引起大鼠啃食皮瓣，使皮瓣模型的損壞率上升。在正常狀態下，大鼠腹部皮瓣平均血流灌注量低于背部，經血管夾夾閉并松開后，血流恢復緩慢，相比于缺血再灌注損傷造成的壞死，因缺血造成的皮瓣壞死面積所占比例增加，降低了實驗結果的可信度。

近年來，Vourtsis等[11]、Wang等[12]分別研究了VEGF和bFGF對缺血再灌注損傷皮瓣成活的影響，Lima等[13]研究了電針刺激對皮瓣缺血再灌注損傷中氧化應激程度的影響，Vasilenko等[14]、Li等[15]分別研究了甲酸雌二醇和富含血小板的血漿對皮瓣缺血再灌注損傷皮瓣成活的影響，這些研究均采用大鼠背部皮瓣模型，這些研究大都采用背部任意皮瓣模型。目前，在皮瓣缺血再灌注損傷導致的皮瓣壞死與凋亡的通路研究中，背部皮瓣模型也更多地被應用。腹部皮瓣與背部皮瓣因所處位置的不用，兩種皮瓣的血管分布、組織厚度和血運情況也存在差距。盡管更為復雜的如細胞因子等表達的差異難以進行直接比較，但從實驗動物成活率、皮瓣完整程度、皮瓣成活率及凋亡指數的穩定性等直接關系到實驗成功率的指標上考量，背部皮瓣模型在研究皮瓣缺血再灌注損傷時更具優勢。endprint

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（收稿日期：2014-03-11 本文編輯：蘇 暢）endprint