銅和鎳對大麥根伸長的聯合毒性研究

鐘 旭，宋寧寧，王學東，馬義兵,*

1. 首都師范大學資源環境與旅游學院，北京 1000482. 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081

銅和鎳對大麥根伸長的聯合毒性研究

鐘 旭1,2，宋寧寧2，王學東1，馬義兵2,*

1. 首都師范大學資源環境與旅游學院，北京 1000482. 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081

重金屬的復合污染在環境污染中普遍存在，所以復合污染的聯合毒性研究對于準確評價重金屬污染有著重要的意義。本論文以大麥根伸長為研究對象，探索了銅(Cu)和鎳(Ni)對大麥根伸長的聯合毒性。基于Cu-Ni混合物的劑量-效應曲線，運用擴展的濃度加和(CA)與獨立作用(RA)兩個模型對不同濃度組合的Cu-Ni混合物的交互作用及聯合毒性進行預測。結果表明，擴展的CA和RA模型均能較好地預測Cu-Ni混合物對大麥根伸長的聯合毒性，低劑量的Ni能緩解Cu對大麥根伸長的毒性作用，但是低劑量的Cu對Ni的生物毒性沒有顯著影響。研究闡明了Cu、Ni復合作用對大麥根伸長聯合毒性的效應機理。

聯合毒性；銅；鎳；濃度加和模型；獨立作用模型；

目前環境中重金屬的風險評估和質量標準制定通常是以單一元素的生態毒性數據為依據的，但是自然環境中的生物往往暴露于多種重金屬組成的混合污染物而非單一污染物中。重金屬在混合物中的毒性變化很大，它們作用于生物體時往往會發生與單一重金屬完全不同的聯合毒性作用[1-2]。即使每種重金屬濃度低于無觀測效應濃度(NOEC)時，其混合物也可能對生物產生顯著的聯合毒性，這一現象可歸因于不同重金屬之間的交互作用[3]。研究重金屬混合物中各組分生物效應間的交互作用及這些作用對生物毒性的影響，對闡釋重金屬聯合毒性作用機理和評價重金屬聯合毒性作用具有重要的意義。

在生態毒理學中，混合物聯合毒性分析中最常用的定量預測模型是濃度加和模型(concentration addition, CA)和獨立作用模型(independent addition, RA)。CA模型一般用來預測具有相同或者相似毒性作用機制的化學物質的聯合毒性，它認為如按一定比例用一種化學物質代替另外一種化學物質時，混合物的毒性不改變[4]。與CA模型相對應的是RA模型，它適用于具有相異作用模式的化學物質組成的混合物的聯合毒性的預測，它依賴于已知化學物質的單一毒性效應來評估總體毒性[5]。盡管有時混合物組分并不是嚴格遵守相同或者相似的毒性作用方式，CA和RA 模型目前已成為預測環境中混合物毒性的參考模型[6-8]。

銅(Cu)是生物體必需的微量元素，鎳(Ni)是生物體的有益元素，但二者又是環境中常見的重金屬污染物，過量的Cu和Ni會對生物體產生毒性效應。國內外研究者以大量生物毒性測試數據為基礎構建了較為完善的Cu和Ni的生物毒性預測模型[9-13]，但是這些研究通常是基于單一重金屬元素指標而非復合污染效應進行的。針對目前環境中Cu-Ni復合污染的高生態風險問題，本研究以土壤模擬溶液中的大麥根伸長為研究對象，采用基于混合物假定線性相互作用的擴展的CA和RA模型研究Cu-Ni的聯合毒性[6]，探討不同Cu-Ni組合與生物毒害的關系，確定復合污染下Cu、Ni之間的交互作用模式，以期為闡明Cu-Ni對大麥根伸長的聯合毒性效應機理以及建立重金屬復合污染的生態風險評價方法體系提供科學理論依據。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

二水合氯化銅(CuCl2·2H2O)、六水合氯化鎳(NiCl2·6H2O)、氯化鈣(CaCl2)和氫氧化鈉(NaOH)溶液均為分析純或優級純，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)為Sigma公司進口產品。大麥種子購自河南省農業科學院培育的駐大麥6號。

1.2 實驗設計

設Cu、Ni兩個組，每組實驗均以0.2 mmol·L-1的CaCl2為背景溶液，對于每個組，每組實驗變化Cu(或Ni)濃度，并伴有Ni(或Cu)濃度的變化。通過添加CuCl2母液配置Cu2+的濃度范圍為0.00，0.10，0.25，0.50，0.80，1.00，2.50 μmol·L-1，添加的Ni2+為0，0.10，0.25，0.40，0.50 μmol·L-1；通過添加NiCl2母液配置Ni2+的濃度范圍分別為0，0.01，0.5，2.5，5，10，20 μmol·L-1，添加的Cu2+為0，0.05，0.10，0.25，0.5 μmol·L-1。溶液的pH值均為6.5。

1.3 溶液配置

使用1 mol·L-1的NaOH、1 mol·L-1的HCl及不能與金屬絡合的緩沖劑MES調節培養液pH值至6.5[14]。通過添加CuCl2母液配置6個Cu濃度，添加NiCl2配置6個Ni濃度，每組實驗添加6組Ni或者Cu。每個Cu濃度或Ni濃度設置3個重復。

1.4 植物培養

大麥根長抑制實驗參照ISO標準(11269-1)[15]。大麥種子用10%的次氯酸鈉消毒洗凈后置于水培裝置中。每個處理為6粒種子，暴露于裝有供試溶液的燒杯中，每個處理設置3個重復，置于RHZ-800智能人工氣候箱中培養。培養條件如下，白天光照12～14 h，溫度為(24±2 ℃)；夜間光照8～12 h，溫度為(18±2 ℃)。光照強度為25 000 lux。每隔1 d更換1次溶液，培養5 d后測定根長，并依據公式(1)計算不同處理下的相對于對照的根的伸長百分比(RE，%)：

(1)

式中，REt代表不同Cu、Ni濃度處理的根伸長(cm)，REc代表對照根伸長(cm)。

1.5 Cu、Ni毒性閾值的計算

Cu、Ni形態采用WHAM 6.0軟件計算[16]，輸入參數為溶液中陰陽離子濃度和pH值。由于試驗為開放系統，因此CO2的分壓取3.5×10-4atm。EC50擬合采用log-logistic曲線(公式(2))擬合。

(2)

式中，Y為相對于對照的大麥根伸長百分比(%)；X為總Cu(Ni)濃度或自由Cu2+(Ni+)活度；Y0、M和b表示擬合常數；M為log(EC50)，EC50為大麥根伸長受到50%抑制時Ni(Ni+)或Cu(Cu2+)的含量。EC50的顯著性檢驗采用澳大利亞科學和工業研究組織內部交流軟件計算出95%置信區間(95% C.I.)，如果兩個EC50的95%置信區間不重疊，表示兩個EC50存在顯著性差別，否則表示兩個數值差別不顯著。

1.6 CA和RA模型的數學描述

當溶液pH=6.5時，自由離子Cu2+、Ni2+為主要的毒性形態，因此應用CA和RA模型對Cu、Ni混合物的聯合毒性進行預測時，只考慮了對大麥根伸長起主要作用的毒性形態Cu2+和Ni2+[13,17]。考慮到混合物中Ni對Cu的解毒作用，將代表Ni對Cu毒性影響的擴展系數c12引入到CA和RA擴展模型中。因為低劑量的Cu對Ni的生物毒性沒有顯著影響(表1)，因此不再考慮Cu對Ni毒性影響的擴展系數c21。

基于兩種毒性呈線性相互作用的假設，CA模型中大麥在Cu-Ni混合溶液中的相對根長(RE)可以表示為方程(3)[6]。式中c1代表混合溶液中Cu2+毒性的強度系數；c12表示Ni對Cu2+毒性影響的擴展系數；c2代表Cu溶液中Ni2+毒性的強度系數；d1表示擬合常數。{Cu2+}、{Ni2+}代表離子活度。

(3)

基于兩種毒性呈線性相互作用的假設，效應加和模型(RA)中大麥在Cu-Ni混合溶液中的相對根長(RE)可以表示為方程(4)，式中參數含義參考方程(2)，d1、d2表示擬合常數。

(4)

2 結果(Results)

2.1 Cu 和Ni 對大麥根伸長的毒性效應

不同Cu和Ni處理下的劑量—效應曲線如圖1所示，從劑量—效應曲線計算得到的Cu和Ni的毒性閾值EC50列于表1。當溶液pH為6.5時，隨著低劑量Ni的加入，EC50{Cu2+}值從0.48增大到1.21，增大了2.52倍，表明低劑量范圍內，隨著Ni濃度的增加，Cu對大麥根伸長的毒性在逐漸減弱。但是，低劑量Cu加入時，EC50{Ni2+}值在4.36～5.43之間波動，并無顯著性變化，表明低劑量范圍內，隨著Cu濃度的增加，Ni對大麥根伸長的急性毒性沒有顯著變化，Cu對Ni的毒性沒有顯著影響。

表1 不同處理下供試溶液的化學成分及EC50值和其95%置信區間Table 1 Composition of the test media used in the various bioassay sets and observed EC50 for barley root elongation and 95% confidence intervals μmol·L-1

圖1 Cu、Ni劑量效應曲線Fig. 1 Toxicity of Cu (Ni) to barley root elongation expressed as dose-response curves

2.2 CA和RA擴展模型參數的估算

通過DPS9.0軟件對CA和RA擴展模型進行擬合，得到的各參數見表2。兩個模型擬合得到Cu2+和Ni2+毒性的強度系數差別不大，分別為 6.04和6.07(logKCu)，5.27和5.23(logKNi)，表明在pH 6.5 條件下Cu2+對大麥根伸長的毒性要大于Ni2+。利用CA擴展模型擬合的代表Ni對Cu的作用的強度系數c12為4.96，遠遠小于RA擴展模型的擬合值6.37，表明Cu、Ni之間相互作用的大小會因假定的Cu、Ni之間作用方式的不同而變化，但CA和RA兩個擴展模型擬合結果均為低劑量的Ni對Cu有強烈的解毒能力。

圖2為兩種模型預測的大麥相對根伸長與實測大麥相對根長的比較。兩種模型對Cu-Ni對大麥根長聯合毒性的預測結果相同。趨勢線的斜率、截距、R2值以及和1:1直線的吻合程度表明CA和RA擴展模型的預測和實測大麥根長都具有較好的相關性，均能較準確的模擬復合金屬對大麥急性毒性的影響。

表2 濃度加和(CA)和效應加和(RA)擴展模型的擬合參數Table 2 Parameters associated with extended concentration addition (CA) and response addition (RA) models

圖2 預測和實測大麥根伸長相關關系Fig. 2 Relationship between predicted and observed barely root elongation

3 討論(Discussion)

本論文研究了Cu、Ni對大麥根伸長的聯合毒性時發現Ni能明顯緩解Cu對大麥根伸長的毒害作用，但是低劑量的Cu對Ni的毒害沒有顯著影響。有關重金屬復合污染對植物的聯合毒性效應方面，已有文獻表明： Cd+Zn組合對蠅子草(Silenevulgaris)重金屬的吸收表現為拮抗作用,而Cu+Zn、Cu+Cd組合則表現為協同作用[18]。Zn2+能夠顯著緩解Cu2+對生菜(Lactucasativa)的毒性，而Cu2+對Zn2+的毒性沒有顯著影響[6]； Cd2+和Zn2+在土豆體內具有相互促進吸收積累的機制，二者呈協同作用，但在大白菜和野生莧中Cd2+具有抑制Zn2+吸收積累的機制，兩者呈拮抗作用[19]。重金屬之間對生物的聯合毒性效應可以表現為相加作用、拮抗作用或協同作用。其作用機理大多與金屬硫蛋白的生物合成有關，動植物體內的金屬硫蛋白能螯合部分重金屬，并對重金屬的動態平衡及其存在形式具有重要作用[20]。正常情況下，金屬硫蛋白在生物體內的含量很低，但當生物受到重金屬脅迫時，其體內會誘導合成金屬硫蛋白，進入細胞內的重金屬就會結合到這類新合成的蛋白質上，或取代原來結合在該蛋白上的其它金屬[21]。Cu2+和Ni2+對大麥根伸長的聯合毒性表現為拮抗作用，可能是Cu2+和Ni2+在與金屬硫蛋白結合時發生競爭性抑制所致。Cu2+和Ni2+能與生物體內的硫蛋白結合生成銅硫蛋白、鎳硫蛋白，不同金屬硫蛋白的穩定性存在一定差異，鎳硫蛋白穩定性小于銅硫蛋白，Cu2+與鎳硫蛋白中的Ni2+發生置換反應生成銅硫蛋白，從而降低了體液中Cu2+的濃度，致使Cu2+毒性降低。重金屬混合物的聯合毒性除不同重金屬離子與金屬硫蛋白的親合力或螯合飽和度存在差異有關外[7]，還與各種重金屬離子的質量濃度水平及質量濃度組合有關[22-23]，因此它們之間的相互作用機制遠比單一重金屬的作用要復雜得多。

本研究中應用擴展后的CA和RA兩個模型均能較好地預測Cu、Ni的聯合毒性，均表明Ni對Cu的解毒作用，且對它們之間的相互作用進行了定量分析。擴展后的CA和RA模型在估算重金屬的混合毒性方面有一定的優勢，它考慮到混合重金屬所有潛在的相互作用，在數學表達式中引入了擴展系數cij的計算，而非傳統意義上在某個響應水平的濃度或活性的單一值。利用這種建模方法能夠繪制完整的劑量效應曲線，描述混合物的毒性，提供了互動混合物的毒性的定量評估。本研究中CA和RA兩個擴展模型對Cu、Ni混合物聯合毒性的預測結果差異不明顯，無法確定Cu、Ni對大麥根伸長的作用機制是相同還是相異。在環境混合物的聯合毒性評價的最佳參考模型是選擇CA還是RA一直都是富有爭議的。張亞輝等[24]在研究一組氯酚化合物對大型溞的聯合毒性時發現，利用CA模型擬合的結果更接近實際觀察值，RA傾向于“低估”實際的聯合毒性。Versieren[8]等研究了Cu-Ni對大麥根長的聯合毒性發現RA模型比CA模型更準確。Yen Le[6]在研究Cu2+-Zn2+，Cu2+-Ag+對生菜(Lactucasativa)根伸長抑制毒性時，發現Cu2+-Zn2+，Cu2+-Ag+的聯合毒性既可用CA模型，也可用RA模型進行評價。環境中存在的污染物的作用機理或作用方式大都是未知的，且對混合物組分作用機制的“相似”和“相異”并沒有一個明確范圍的界定，因此，CA和RA兩個模型的應用范圍比較寬泛，而非嚴格按照其定義中的“相似”和“相異”去判別混合物的聯合毒性。

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◆

JointToxicityofCu-NitoBarleyRootElongation

Zhong Xu1,2, Song Ningning2, Wang Xuedong1, Ma Yibing2,*

1. College of Resource Environment and Tourism, Capital Normal University, Beijing 100048, China2. Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

3 June 2014accepted10 August 2014

The combined pollution of heavy metals is common in the environment pollution, so that the joint toxicity of heavy metals is important for risk assessment of contamination of heavy metals in environments. In the present study, the joint toxicity of copper (Cu) and nickel (Ni) to barley root elongation was studied based on dose-effect curves. Furthermore, the interactions of Cu2+-Ni2+were included in quantitatively estimating toxicity of Cu-Ni mixtures by linearly expanding the concentration addition (CA) and response addition (RA) models. It was demonstrated that both extended CA and extended RA models could be employed to predict the joint toxicity of Cu and Ni to barley root elongation. Results showed that Ni in a low dose had a significant alleviative effect on Cu toxicity while Cu in a low dose did not affect Ni toxicity significantly. The present study explained the mechanism of the Cu-Ni joint toxicity to barley root elongation.

joint toxicity; copper; nickel; concentration addition model; response addition model

2014-06-03錄用日期：2014-08-10

1673-5897(2014)4-751-06

： X171.5

： A

馬義兵(1957—)，男，河北保定人，研究員，主要從事土壤重金屬環境風險評價和治理.

國家自然科學基金項目(40971262)；公益性行業(農業)科研專項項目(200903015)

鐘旭(1988-)女，碩士，研究方向：土壤重金屬生態風險評價，E-mail：zhongxvhuanke@sina.com

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: ybma@caas.ac.cn

10. 7524/AJE. 1673-5897. 20140510004

鐘 旭，宋寧寧，王學東，等. 銅和鎳對大麥根伸長的聯合毒性研究[J]. 生態毒理學報, 2014, 9(4): 751-756

Zhong X, Song N N, Wang X D, et al. Joint toxicity of Cu-Ni to barley root elongation [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(4): 751-756 (in Chinese)