哮喘患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的測定及臨床意義

湛潔誼　盧慧敏　林穗玲

[摘要] 目的 探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在哮喘兒童外周血中的比例改變，并探討其臨床意義。 方法 150例哮喘患兒按臨床表現(xiàn)分為急性發(fā)作組（50例）、臨床緩解期組（50例）和咳嗽變異性哮喘組（50例），另選擇50名健康兒童為正常對照組。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測上述各組外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比。 結(jié)果 急性發(fā)作期組患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平較緩解組、咳嗽變異性哮喘組及健康對照組明顯下降（P<0.05），而緩解期組及咳嗽變異性哮喘組與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與了哮喘的發(fā)生與發(fā)展，哮喘的嚴(yán)重程度可能與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 哮喘；兒童；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

[中圖分類號] R562.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）25-0010-03

支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是一類調(diào)節(jié)或抑制其他免疫細(xì)胞功能的細(xì)胞，在自身免疫性疾病、感染性疾病、過敏性疾病以及腫瘤免疫中都發(fā)揮著作用。近年來，研究資料顯示，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在哮喘的發(fā)病中可能起著重要作用。本文通過檢測不同時期及不同類型哮喘患者外周血CD4+CD25+Treg的表達(dá)水平，探討該細(xì)胞表達(dá)水平與哮喘發(fā)病的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象

選擇2010～2013年廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科門診哮喘患者150例，均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組制定的哮喘及其分期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。急性發(fā)作期哮喘患兒50例，其中男26例，女24例，年齡2～9歲，平均（4.982±0.263）歲；臨床緩解期哮喘患兒50例，其中男27例，女23例，年齡2.5～11歲，平均（5.308±0.275）歲；咳嗽變異性哮喘患兒50例，其中男24例，女26例，年齡3～10歲，平均（5.160±0.249）歲。對照組50例，為廣州市天河區(qū)婦幼保健院健康體檢兒童，其中男25例，女25例，年齡2～10歲，平均（5.064±0.223）歲，均無自身免疫性疾病、過敏性疾病以及腫瘤疾病史，近2個月內(nèi)無感染性疾病，并除外近3個月內(nèi)使用腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或其他免疫調(diào)節(jié)劑史。各組的性別構(gòu)成、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

1.2主要試劑與儀器

鼠抗人的CD4-FITC，CD25-PE，及同型對照單抗，F(xiàn)AC lysing solution溶血素，流式細(xì)胞儀FACScanto，以上試劑及儀器均購自美國Becton Dickinson公司。分析軟件為FACSDiva software。

1.3外周血CD4+CD25+Treg的檢測

抽取研究對象外周靜脈血2mL，用EDTA抗凝。取兩支流式上樣管，分別加入EDTA抗凝全血50 μL，第一管加同型對照，第二管加CD4-FITC，CD25-PE，各為 10μL，室溫避光孵育15～20 min，然后加入FASC 溶血素1 mL，混合后避光靜置10 min，1000 r/min離心3 min，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，加入適量PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。以CD4陽性細(xì)胞設(shè)門，分析CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞的百分比。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，定量資料（年齡、CD4+CD25+ Treg占CD4+ T細(xì)胞的比例）用Kolmogorov-Smirnov檢驗法進(jìn)行正態(tài)性檢驗，對于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，結(jié)果以（x±s）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，方差分析整體均數(shù)間有統(tǒng)計學(xué)意義時，選用S-N-K檢驗做組間的兩兩比較。定性資料（性別構(gòu)成）比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 研究對象年齡、性別構(gòu)成比較

見表1。

2.2 不同組別外周血中CD4+CD25+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例比較

急性發(fā)作期哮喘患兒外周血CD4+CD25+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例明顯低于健康對照兒童、臨床緩解期哮喘患兒及咳嗽變異性哮喘患兒（P<0.05）。臨床緩解期哮喘患兒及咳嗽變異性哮喘患兒與健康對照兒童比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P>0.05）。臨床緩解期哮喘患兒與咳嗽變異性哮喘患兒比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

CD4+CD25+Treg是CD4+T細(xì)胞的一個小的細(xì)胞亞型，具有免疫功能性和抑制性兩大功能特征[2]。近年來，研究資料顯示，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在哮喘的發(fā)病中可能起著重要作用。它可介導(dǎo)機(jī)體對過敏原耐受的形成，維持免疫耐受，抑制Th2反應(yīng)及氣道的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥，從而下調(diào)哮喘氣道炎癥，最終起到防止哮喘發(fā)展的作用[3]。CD4+CD25+Treg水平已成為衡量Treg群落大小的一個重要參數(shù)，然而，對于哮喘患者外周血CD4+CD25+Treg水平的報道尚不一致。多項研究表明[4，5]，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液、外周血單核細(xì)胞中CD4+CD25+Treg的比率明顯低于健康對照組。黃花榮、陸小霞等[6，7]通過對哮喘患兒外周血CD4+CD25+Treg 的研究表明，哮喘患兒急性發(fā)作期的CD4+CD25+Treg明顯降低，且隨著病情的加重呈明顯減少的趨勢。但也有少部分研究認(rèn)為哮喘患者外周血CD4+CD25+Treg水平與健康對照組比較無差別[8，9]，甚至是升高的[10，12]。咳嗽變異性哮喘是哮喘的一種特殊類型，以咳嗽為唯一或主要表現(xiàn)，不伴有明顯喘息。畢玉田等[13]研究發(fā)現(xiàn)，咳嗽變異性哮喘患者外周血的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例顯著低于健康對照者。endprint

該實驗研究表明，哮喘急性發(fā)作期患兒的外周血CD4+CD25+Treg水平較臨床緩解期哮喘患兒、咳嗽變異性哮喘患兒和正常對照組兒童明顯下降，這與大部分的研究結(jié)論一致，提示哮喘急性發(fā)作期患兒體內(nèi)存在T調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能平衡失調(diào)，導(dǎo)致免疫抑制功能減弱或呈低反應(yīng)性，可能是引起支氣管哮喘發(fā)病的機(jī)制之一。而該實驗研究也表明臨床緩解期哮喘患兒及咳嗽變異性哮喘患兒外周血CD4+CD25+Treg水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明哮喘患兒癥狀緩解可能與體內(nèi)CD4+CD25+Treg的水平恢復(fù)有關(guān)。同時咳嗽變異性哮喘患兒的病情輕，可能CD4+CD25+Treg的水平下降不明顯。該實驗研究表明哮喘的嚴(yán)重程度可能與CD4+CD25+Treg的水平相關(guān)，同時也存在不能單純依靠CD25+來區(qū)分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞的可能。目前關(guān)于咳嗽變異性哮喘與CD4+CD25+Treg水平的研究較少，尚需大量的樣本驗證及進(jìn)一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組. 2008年修訂兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J]. 中華兒科雜志，2008，46（10）：745-753.

[2] Lloyd CM，Hawrylowicz CM. Regulatory T cells in asthma[J]. Immunity，2009，31（3）： 438-449.

[3] Shi HZ，Qin XJ. CD4+CD25+regulatory T lymphocytes in allergy and asthma[J]. Allergy，2005，60（8）：986-995.

[4] Xue kY， Zhou YM， Xiong SD， et al. Analysis of CD4+CD25+ regulatory T cells and Foxp3 mRNA in the peripheral blood of patients with asthma[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci， 2007，27（1）：31-33.

[5] 高洪媛，劉瑞娟. CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少對哮喘患者的影響[J]. 臨床肺科雜志，2012，17（2）：335-336.

[6] 黃花榮，劉甜甜，麥賢弟，等. 哮喘患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及其與哮喘病情的關(guān)系[J]. 新醫(yī)學(xué)，2009，40（4）：221-223.

[7] 陸小霞. 哮喘兒童外周血單個核細(xì)胞Tim-3 mRNA的表達(dá)及其與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2011，40（1）：60-63.

[8] 梁瑞韻，伍衛(wèi)，黃瑾，等. 鎂對哮喘患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡及Foxp3表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志，2012，28（9）：1690-1694.

[9] Ling EM，Smith T，Nguyen XD，et al. Relation of CD4+CD25+ regulatory T-cell suppression of allergen-driven T-cell activation to atopic status and expression of allergic disease[J]. Lancet，2004，363（9409）：608-615.

[10] 覃壽明，施煥中，覃雪軍，等. 支氣管哮喘患者外周血中的CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的測定[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29（4）：252-256.

[11] 施勝銘，輔桓欽. 支氣管哮喘患者外周血中的CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的變化和干預(yù)意義[J]. 現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2009，21（9）：969-970.

[12] 沈麗華，吳曉燕. 非急性發(fā)作期哮喘患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量水平觀察[J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9（6）：146-147.

[13] 畢玉田，洪新，曹國強(qiáng)，等. 糖皮質(zhì)激素吸入誘導(dǎo)咳嗽變異性哮喘患者CD4+CD25+T細(xì)胞Foxp3基因表達(dá)的研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2007，36（6）：511-513.

（收稿日期：2014-04-11）endprint

該實驗研究表明，哮喘急性發(fā)作期患兒的外周血CD4+CD25+Treg水平較臨床緩解期哮喘患兒、咳嗽變異性哮喘患兒和正常對照組兒童明顯下降，這與大部分的研究結(jié)論一致，提示哮喘急性發(fā)作期患兒體內(nèi)存在T調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能平衡失調(diào)，導(dǎo)致免疫抑制功能減弱或呈低反應(yīng)性，可能是引起支氣管哮喘發(fā)病的機(jī)制之一。而該實驗研究也表明臨床緩解期哮喘患兒及咳嗽變異性哮喘患兒外周血CD4+CD25+Treg水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明哮喘患兒癥狀緩解可能與體內(nèi)CD4+CD25+Treg的水平恢復(fù)有關(guān)。同時咳嗽變異性哮喘患兒的病情輕，可能CD4+CD25+Treg的水平下降不明顯。該實驗研究表明哮喘的嚴(yán)重程度可能與CD4+CD25+Treg的水平相關(guān)，同時也存在不能單純依靠CD25+來區(qū)分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞的可能。目前關(guān)于咳嗽變異性哮喘與CD4+CD25+Treg水平的研究較少，尚需大量的樣本驗證及進(jìn)一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組. 2008年修訂兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J]. 中華兒科雜志，2008，46（10）：745-753.

[2] Lloyd CM，Hawrylowicz CM. Regulatory T cells in asthma[J]. Immunity，2009，31（3）： 438-449.

[3] Shi HZ，Qin XJ. CD4+CD25+regulatory T lymphocytes in allergy and asthma[J]. Allergy，2005，60（8）：986-995.

[4] Xue kY， Zhou YM， Xiong SD， et al. Analysis of CD4+CD25+ regulatory T cells and Foxp3 mRNA in the peripheral blood of patients with asthma[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci， 2007，27（1）：31-33.

[5] 高洪媛，劉瑞娟. CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少對哮喘患者的影響[J]. 臨床肺科雜志，2012，17（2）：335-336.

[6] 黃花榮，劉甜甜，麥賢弟，等. 哮喘患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及其與哮喘病情的關(guān)系[J]. 新醫(yī)學(xué)，2009，40（4）：221-223.

[7] 陸小霞. 哮喘兒童外周血單個核細(xì)胞Tim-3 mRNA的表達(dá)及其與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2011，40（1）：60-63.

[8] 梁瑞韻，伍衛(wèi)，黃瑾，等. 鎂對哮喘患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡及Foxp3表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志，2012，28（9）：1690-1694.

[9] Ling EM，Smith T，Nguyen XD，et al. Relation of CD4+CD25+ regulatory T-cell suppression of allergen-driven T-cell activation to atopic status and expression of allergic disease[J]. Lancet，2004，363（9409）：608-615.

[10] 覃壽明，施煥中，覃雪軍，等. 支氣管哮喘患者外周血中的CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的測定[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29（4）：252-256.

[11] 施勝銘，輔桓欽. 支氣管哮喘患者外周血中的CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的變化和干預(yù)意義[J]. 現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2009，21（9）：969-970.

[12] 沈麗華，吳曉燕. 非急性發(fā)作期哮喘患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量水平觀察[J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9（6）：146-147.

[13] 畢玉田，洪新，曹國強(qiáng)，等. 糖皮質(zhì)激素吸入誘導(dǎo)咳嗽變異性哮喘患者CD4+CD25+T細(xì)胞Foxp3基因表達(dá)的研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2007，36（6）：511-513.

（收稿日期：2014-04-11）endprint

該實驗研究表明，哮喘急性發(fā)作期患兒的外周血CD4+CD25+Treg水平較臨床緩解期哮喘患兒、咳嗽變異性哮喘患兒和正常對照組兒童明顯下降，這與大部分的研究結(jié)論一致，提示哮喘急性發(fā)作期患兒體內(nèi)存在T調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能平衡失調(diào)，導(dǎo)致免疫抑制功能減弱或呈低反應(yīng)性，可能是引起支氣管哮喘發(fā)病的機(jī)制之一。而該實驗研究也表明臨床緩解期哮喘患兒及咳嗽變異性哮喘患兒外周血CD4+CD25+Treg水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明哮喘患兒癥狀緩解可能與體內(nèi)CD4+CD25+Treg的水平恢復(fù)有關(guān)。同時咳嗽變異性哮喘患兒的病情輕，可能CD4+CD25+Treg的水平下降不明顯。該實驗研究表明哮喘的嚴(yán)重程度可能與CD4+CD25+Treg的水平相關(guān)，同時也存在不能單純依靠CD25+來區(qū)分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞的可能。目前關(guān)于咳嗽變異性哮喘與CD4+CD25+Treg水平的研究較少，尚需大量的樣本驗證及進(jìn)一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組. 2008年修訂兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J]. 中華兒科雜志，2008，46（10）：745-753.

[2] Lloyd CM，Hawrylowicz CM. Regulatory T cells in asthma[J]. Immunity，2009，31（3）： 438-449.

[3] Shi HZ，Qin XJ. CD4+CD25+regulatory T lymphocytes in allergy and asthma[J]. Allergy，2005，60（8）：986-995.

[4] Xue kY， Zhou YM， Xiong SD， et al. Analysis of CD4+CD25+ regulatory T cells and Foxp3 mRNA in the peripheral blood of patients with asthma[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci， 2007，27（1）：31-33.

[5] 高洪媛，劉瑞娟. CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少對哮喘患者的影響[J]. 臨床肺科雜志，2012，17（2）：335-336.

[6] 黃花榮，劉甜甜，麥賢弟，等. 哮喘患兒外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化及其與哮喘病情的關(guān)系[J]. 新醫(yī)學(xué)，2009，40（4）：221-223.

[7] 陸小霞. 哮喘兒童外周血單個核細(xì)胞Tim-3 mRNA的表達(dá)及其與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2011，40（1）：60-63.

[8] 梁瑞韻，伍衛(wèi)，黃瑾，等. 鎂對哮喘患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡及Foxp3表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志，2012，28（9）：1690-1694.

[9] Ling EM，Smith T，Nguyen XD，et al. Relation of CD4+CD25+ regulatory T-cell suppression of allergen-driven T-cell activation to atopic status and expression of allergic disease[J]. Lancet，2004，363（9409）：608-615.

[10] 覃壽明，施煥中，覃雪軍，等. 支氣管哮喘患者外周血中的CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的測定[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29（4）：252-256.

[11] 施勝銘，輔桓欽. 支氣管哮喘患者外周血中的CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的變化和干預(yù)意義[J]. 現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2009，21（9）：969-970.

[12] 沈麗華，吳曉燕. 非急性發(fā)作期哮喘患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量水平觀察[J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2011，9（6）：146-147.

[13] 畢玉田，洪新，曹國強(qiáng)，等. 糖皮質(zhì)激素吸入誘導(dǎo)咳嗽變異性哮喘患者CD4+CD25+T細(xì)胞Foxp3基因表達(dá)的研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2007，36（6）：511-513.

（收稿日期：2014-04-11）endprint