聚乙烯亞胺-黃芪多糖共聚物的制備及其基因傳遞性能觀察*

張丹丹，任雪玲，何阿妹，張 紅，周宇雪，張振中#

1)河南省人民醫院藥學部 鄭州 450003 2)鄭州大學藥學院 鄭州 450001

人類疾病都直接或間接與基因異常有關，因此基因治療已成為治療包括腫瘤在內的多種疾病的有效方法之一[1]。基因治療成功與否的關鍵之一在于高效、低毒的基因傳遞載體[2]。聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是最具代表性的高效基因傳遞載體之一[3]，但其細胞毒性也不容忽視[4]。多糖及其衍生物不僅具有生物相容性好、可生物降解等特點，同時也能夠有效壓縮DNA并將其轉染至細胞內，已逐漸引起人們的關注[5]。但是，多糖通常體內、體外轉染效率較低。有研究[6]顯示，將PEI接枝在多糖上能夠顯著提高基因轉染效率。Wong等[7]在殼聚糖的結構中接枝PEI，所得產物不僅極大提高了基因轉染效率，同時有效降低了細胞毒性。因此，PEI-多糖共聚物已成為目前非病毒基因傳遞載體的研究熱點之一。黃芪是一種重要的中藥材，具有抗氧化、抗病毒、提高免疫力等功效[8]。黃芪多糖是黃芪的主要生物活性成分[9]，不僅具有增強細胞免疫力的功效，同時作為一類多羥基醛酮類化合物，可以提供多個反應基團進行改性。該研究中作者對黃芪多糖進行PEI改性，制備PEI-黃芪多糖共聚物(PEI-RAP)，并進一步研究其與核酸的相互作用，探索其負載核酸作為非病毒基因傳遞載體的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 黃芪多糖(相對分子質量為1.0×104～2.0×104)購自西安斯諾特生物技術有限公司;PEI(相對分子質量為600)購自阿拉丁試劑有限公司;人乳癌細胞MCF-7、人宮頸癌細胞Hela和人肝癌細胞SMMC-7721由鄭州大學基礎醫學院惠贈;綠色熒光蛋白表達載體pEGFP由作者所在的學院構建并保存。十六烷基三甲基溴化銨、羰基二咪唑(CDI)、高碘酸鉀(KIO4)、硼氫化鈉、氮丙啶、乙二胺均為國產分析純。

1.2 PEI-RAP的制備及表征鑒定

1.2.1 氮丙啶法[7]將0.1045 g黃芪多糖Ⅰ加入裝有10 mL去離子水的50 mL圓底燒瓶中，攪拌下加入0.1526 g KIO4，室溫避光反應48 h后將反應溶液裝入透析袋中透析48 h。將透析液滴加至含有200 μL乙二胺的5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 9.8)中，1 h內滴加完畢，室溫攪拌36 h。稱取0.1011 g硼氫化鈉，加入到上述溶液中，攪拌 48 h。再加入0.0504 g硼氫化鈉，繼續攪拌24 h。將上述反應液加入到2 mL 1 mol/L HCl溶液(含400 μL氮丙啶)中，攪拌5 d。最后將反應液透析3 d，冷凍干燥即得產物Ⅱ。

1.2.2 KIO4-PEI法[10]將 0.1023 g 黃芪多糖加入裝有10 mL去離子水的50 mL圓底燒瓶中，攪拌下加入0.1513 g KIO4，避光攪拌48 h后將反應液裝入透析袋中透析48 h。將透析液滴加至含有0.2684 g PEI的5 mL磷酸鹽緩沖液中，1 h內滴加完畢，然后室溫攪拌36 h。將0.1018 g硼氫化鈉加入到上述溶液中，攪拌48 h。再次將0.0502 g硼氫化鈉加入到上述溶液中，繼續攪拌24 h。最后將反應液透析、冷凍干燥即得產物Ⅲ。

1.2.3 CDI-PEI法[11]氮氣保護條件下，向含有0.0780 g黃芪多糖的8 mL DMSO中依次加入100 μL三乙胺、0.2120 g CDI的 DMSO 溶液4 mL，避光劇烈反應4 h。然后向反應液中滴加含0.7568 g PEI的DMSO溶液6 mL，最后加入50 μL三乙胺，避光反應24 h。反應液經透析、冷凍干燥，即得產物Ⅳ。

1.2.4 結構表征鑒定 將少量黃芪多糖以及3種反應產物分別與溴化鉀壓成薄片，在NICOLET iS10型紅外光譜儀上測定傅里葉變換紅外光譜。

1.3 PEI-RAP與pEGFP的作用

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 將PEI-RAP與pEGFP 分別按質量比4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1 混合均勻，室溫靜置30 min。采用北京君意JY600電泳儀以及美國SIM公司Bio-Best 200E凝膠成像分析系統考察PEI-RAP對pEGFP的負載作用。

1.3.2 粒徑與 Zeta電位分析 將 PEI-RAP與pEGFP按質量比12∶1混合均勻，采用英國馬爾文公司 Nano-ZS90納米粒度分析儀測定 PEI-RGP/pEGFP復合物的粒徑與Zeta電位。

1.4 PEI-RAP的細胞毒性 將 MCF-7、Hela和SMMC-7721細胞分別接種于96孔板，在體積分數5%CO2、37℃條件下，于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中常規培養，待細胞融合度達到70% ～80%，加入150 mg/L PEI-RAP，24 h后棄去舊細胞培養液，每孔加入0.5 g/L MTT 100 μL，繼續培養4 h，小心棄去培養液并加入100 μL DMSO，測定570 nm的OD值。細胞存活率=[(OD實驗組－OD空白組)/(OD對照組－OD空白組)]×100%。實驗重復3次。

1.5 pEGFP的體外轉染 MCF-7、Hela和 SMMC-7721細胞分別在含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基和37℃、體積分數5%CO2條件下常規培養。轉染前16 h按照每孔1.2×104個細胞接種于96孔板。將 PEI-RAP與 pEGFP按質量比12∶1(18 mg/L PEI-RAP，1.5 mg/L pEGFP)混勻，室溫培養30 min后轉染細胞。轉染48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察。通過細胞計數法對轉染效率進行定量。實驗重復3次。

2 結果

2.1 PEI-RAP的合成與表征 黃芪多糖以及3種反應的產物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的紅外光譜圖見圖1。通過對比發現，4種樣品中均存在3600～3200 cm－1處的多糖O-H伸縮振動峰及3000～2800 cm－1處的C-H伸縮振動峰。但是，只有產物Ⅱ的紅外譜圖中在1734 cm－1出現了新的特征峰，1734 cm－1是氨基的變形振動峰。實驗結果表明，通過氮丙啶法成功制備得到PEI-RAP，而直接將PEI連接在黃芪多糖上的KIO4-PEI和CDI-PEI法并未得到預期產物。

圖1 樣品的紅外吸收光譜

2.2 PEI-RAP與 pEGFP的相互作用 PEI-RAP共聚物與pEGFP以不同質量比結合后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖2。由圖2可知，隨著PEI-RAP共聚物含量的不斷增加，pEGFP的量及遷移速率受到影響，當兩者的質量比達到10∶1以上時，pEGFP條帶完全消失。實驗結果表明，PEI-RAP可以負載pEGFP，當兩者質量比達到10∶1以上，pEGFP可與PEI-RAP完全結合。

圖2 PEI-RAP負載pEGFP的凝膠阻滯實驗

當PEI-RAP與pEGFP的質量比為12∶1時，PEI-RAP/pEGFP復合物的粒徑為156.61 nm，電位達 +26.89 mV。

2.3 PEI-RAP的細胞毒性 MTT結果顯示，當細胞培養液中加入150 mg/L PEI-RAP復合物，MCF-7、Hela和 SMMC-7721細胞的存活率分別為(102.21 ±8.92)%、(96.07 ±7.10)%和(109.52 ±2.05)%。

2.4 pEGFP的體外轉染 見圖3。轉染pEGFP的MCF-7、Hela和SMMC-7721細胞中均能觀察到綠色熒光。PEI-RAP復合物將 pEGFP轉染至MCF-7、Hela以及SMMC-7721細胞的轉染效率分別是(82.64 ±1.27)%、(85.37 ± 6.10)% 和(93.06 ±0.72)%。

圖3 PEI-RAP負載pEGFP轉染MCF-7(A)、Hela(B)和SMMC-77213(C)細胞株(×200)

3 討論

在基因治療領域，尋找理想的基因傳遞載體仍然是一個挑戰。多糖是自然界中廣泛存在的一種生物大分子，具有很好的生物相容性[12-13]。但是，在多糖結構中缺乏與核酸相互作用的基團，因此轉染效率一直限制其進一步發展。PEI是目前研究最為廣泛的陽離子化非病毒基因傳遞載體。在PEI的表面含有大量氨基，從而攜帶大量正電荷。這些正電荷的存在不僅使得PEI可以與負電荷的DNA形成穩定的納米復合物，而且能夠通過細胞膜的內吞作用進入細胞內，同時在細胞內通過質子海綿效應釋放DNA，從而達到高效傳遞治療基因的目的。但是，也正是由于這些高密度正電荷的存在，使PEI表現出一定的細胞毒性[14]。有研究[15-16]顯示，將多糖與PEI連接在一起，可以得到一種新型的多糖-PEI復合載體，它不僅具有高基因轉染效率，同時不表現出明顯的細胞毒性。新型的多糖-PEI復合載體已成為非病毒基因傳遞載體的研究熱點之一。

該研究所選用的黃芪多糖不含有陽離子基團，因此其本身并不適合作為基因傳遞載體。作者采用化學方法以PEI對黃芪多糖進行陽離子改性，希望能夠得到一種新的非病毒基因傳遞載體。PEI-多糖的制備通常有兩種策略，一種是以氮丙啶為單體，直接在多糖分子上聚合得到;另外一種是采用一定反應將多糖分子直接與PEI連接在一起。該研究中，作者嘗試用氮丙啶法、KIO4-PEI法和CDI-PEI法制備PEI-RAP。紅外吸收光譜顯示通過氮丙啶法構建得到了PEI-RAP復合物，而另外兩種方法并未得到目的產物，這可能與黃芪多糖的結構有關。文獻[17]顯示，黃芪多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、木糖等單糖組成，在其分子結構中含有1條主鏈和多種形式的支鏈，其復雜的分支結構可能限制相對分子質量較大的PEI的直接連接，造成KIO4-PEI和CDI-PEI法均未得到預期產物。

PEI-RAP與DNA相互作用實驗顯示，PEI-RAP可以有效負載DNA。另外，PEI-RAP幾乎不顯示細胞毒性，并且能夠將pEGFP轉染至3種細胞，成功表達出綠色熒光，具有較高的轉染效率。因此，以黃芪多糖為骨架的新型陽離子聚合物PEI-RAP是一種有效的、有潛在應用前景的非病毒基因傳遞載體。

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