宮頸癌患者外周血中髓源抑制細胞比例變化及CD73的表達*

封全靈，王紅麗，張 毅，史惠蓉，張 斌

1)鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院婦產科 鄭州 450052 4)美國芝加哥西北大學醫學院血液腫瘤中心 芝加哥 60611

宮頸癌是嚴重威脅婦女健康的疾病，宮頸癌的發生與機體免疫功能下降有關。腫瘤細胞與機體免疫系統相互作用，最終使腫瘤細胞產生了免疫逃逸的功能[1-2]。髓源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)能夠抑制T細胞介導的抗腫瘤免疫反應[3]。腫瘤患者外周血MDSCs的表達與腫瘤發生發展關系密切，在前列腺癌、肺癌、結腸癌、乳癌等腫瘤組織中均可檢測到MDSCs，可發揮不同機制的免疫抑制功能[4]。近來發現CD73是一種重要的免疫抑制分子[5]，相關動物實驗[6-7]表明小鼠MDSCs上CD73表達增高，進而使胞外核苷酸酶增多，腺苷聚集，發揮免疫抑制功能。而MDSCs是否與宮頸癌患者的細胞免疫功能抑制有關及宮頸癌MDSCs介導的T細胞免疫抑制作用與CD73的表達是否有關，尚不清楚。該研究探討了宮頸癌患者外周血中粒細胞樣髓源抑制細胞(granulocytic-MDSCs，G-MDSCs)和單核細胞樣髓源抑制細胞(monocytic-MDSCs，M-MDSCs)的比例變化及CD73在兩群MDSCs上的表達，為宮頸癌的免疫治療提供依據，并為進一步研究MDSCs在宮頸癌免疫抑制中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年12月至2013年6月鄭州大學第一附屬醫院及第三附屬醫院宮頸癌初治患者術前外周血標本37例?；颊吣挲g25～75(47.2 ±9.3)歲;鱗癌23 例，腺癌14 例;國際婦產科聯盟(FIGO)臨床分期:Ⅰ期11例，Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期10例;低分化16例，中、高分化21例;有淋巴結轉移13例，無淋巴結轉移24例。所有患者均經宮頸活檢或手術病理檢查證實。21例健康者作對照，年齡26～72(45.4±11.5)歲。健康者及患者均無其他系統疾病。

1.2 標本的制備 清晨空腹狀態下采用無菌靜脈穿刺術采集患者及健康人外周靜脈血6 mL，肝素鈉抗凝。離心后棄上層血清，生理鹽水稀釋，以體積比2∶1加入人淋巴細胞分離液(上海華清生物高科技有限公司產品)，2500 r/min離心25 min，吸管提取單個核細胞層，生理鹽水稀釋后洗細胞2次，1500 r/min離心10 min，棄上清。調整細胞密度至106mL－1。

1.3 G-MDSCs、M-MDSCs及 CD73 表達的檢測采用流式細胞術。PE-cy7-CD11b抗體、APC-cy7-CD14抗體、FITC-CD73抗體及相應的同型對照IgG2-PE-cy7抗體、IgG2-APC-cy7抗體、IgG2-FITC抗體購自美國BD公司。將每份標本細胞分離后均分成2份，轉至1.5 mL離心管中備用(每個離心管100 μL)。在超凈工作臺中上述離心管底部分別加入PE-cy7-CD11b抗體、APC-cy7-CD14抗體、FITCCD73抗體及同型對照抗體(對照)，充分混勻后至4℃避光孵育15～20 min，后加300 μL PBS緩沖液并混勻懸浮細胞，流式細胞儀檢測。以同型對照流式管作為對照管，檢測時在前向-側向散射光(FSCSSC)的二維散射圖形上先確定外周血單個核細胞分布，以 CD11b+CD14+細胞為 M-MDSCs，CD11b+CD14－細胞為G-MDSCs，圈選出兩群細胞后，再分析CD11b+CD14+細胞中CD73陽性的細胞即為MMDSCs上CD73的表達水平，CD11b+CD14－細胞中CD73陽性的細胞即為G-MDSCs上CD73的表達水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析。宮頸癌患者與健康者外周血中G-MDSCs、M-MDSCs及其CD73的表達、不同臨床特征的宮頸癌患者MDSCs及其CD73表達差異比較采用單因素方差分析或兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組外周血中G-MDSCs及 M-MDSCs的比例變化及CD73的表達 見表1。

表1 2組外周血中MDSCs的比例變化及CD73的表達 %

2.2 宮頸癌患者外周血MDSCs及CD73的表達與臨床特征的關系 宮頸癌組外周血中G-MDSCs的比例及其CD73的表達與病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結轉移均無關(P＞0.05)，M-MDSCs比例及其CD73的表達水平與臨床分期有關，臨床分期越高，M-MDSCs及其CD73表達水平越高(P＜0.05);宮頸癌組外周血中M-MDSCs上CD73的表達與淋巴結轉移有關(P＜0.05)。見表2。

表2 宮頸癌患者外周血中MDSCs比例及其CD73的表達與臨床特征的關系 %

3 討論

MDSCs是一群未成熟的髓系細胞的異質性群體，在外周器官激活后發揮免疫抑制和逃逸的功能，在病理情況下，未成熟髓樣細胞分化受阻而大量聚集，即為MDSCs[3]。人類MDSCs缺乏特異性表面標志物[8]，不同腫瘤患者體內 MDSCs表型不盡相同[9-10]。Feng等[11]在非小細胞肺癌研究中認為，CD11b+CD14+為M-MDSCs標志物，CD11b+CD14－為G-MDSCs標志物，該研究MDSCs的表型分類亦是基于此原理。

Feng等[11]的研究表明肺癌患者 M-MDSCs和G-MDSCs的比例較正常組都升高，但在患者外周血中M-MDSCs的比例較G-MDSCs高，根據實體瘤的療效評價，進展期腫瘤中M-MDSCs的比例最高，并且有臨床相關性。Diaz-Montero等[12]發現乳癌患者外周血中MDSCs的比例與腫瘤的分級相關。該實驗第一步對兩群MDSCs在宮頸癌患者中的分布進行研究，結果顯示G-MDSCs、M-MDSCs在患者外周血中的分布較健康組增加，M-MDSCs表達與患者的臨床分期有關，表明宮頸癌患者體內腫瘤細胞相關因子可誘導其外周血MDSCs比例的上調，MDSCs與宮頸癌的發生關系密切;隨著臨床分期的增加，宮頸癌患者M-MDSCs的比例也明顯升高，宮頸癌患者外周血M-MDSCs水平可能與病情進展有關，與上述研究結果一致;但患者外周血中M-MDSCs比例較GMDSCs低，考慮可能和腫瘤細胞差異性及不同腫瘤體內MDSCs分泌的相關抑制性細胞因子有關。

MDSCs通過多條途徑抑制機體細胞免疫功能而發生腫瘤免疫逃逸:可高表達精氨酸酶和誘導性一氧化氮合酶，參與L-精氨酸代謝使T細胞上CD3 ζ鏈表達減少，抑制T細胞增殖等[4];高表達活性氧族、過氧亞硝酸鹽等，通過細胞接觸方式誘導T細胞功能下降[13];另外，也可通過分泌多種細胞因子如 TGF-β、IL-10、PGE2 等起抑制作用[14]。CD73 在肺癌、胰腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達[5]，在缺氧條件下，促使腫瘤微環境中腺苷聚積，從而發揮免疫抑制效應[15]。MDSCs能夠誘導調節性T細胞(Treg)產生，而Tregs上CD73過表達使腺苷聚集而發揮免疫抑制作用。相關動物實驗[6-7]表明小鼠MDSCs上CD73表達增高，促進MDSCs發揮免疫抑制功能。

目前發現兩群MDSCs能通過不同的作用機制抑制機體免疫功能的正常發揮[14]。實驗第二步就兩群MDSCs上CD73的表達進行研究，在外周血中G-MDSCs上CD73低表達，且與健康組相比差異無統計學意義;CD73在宮頸癌組M-MDSCs上高表達，且與病理分期和淋巴結轉移有關。由于不同病理環境中MDSCs所處的機體微環境不同，可致MDSCs抑制機體免疫功能機制有差異，有研究[3]表明GMDSCs在免疫抑制中也發揮重要作用，但該研究表明G-MDSCs可能不通過誘導CD73的表達而是其他的作用方式抑制機體免疫功能，關于G-MDSCs免疫抑制的具體途徑及參與的相關腫瘤細胞因子有待進一步的探討;宮頸癌患者外周血中M-MDSCs上CD73的高表達且與臨床分期相關，提示M-MDSCs與疾病進展密切相關，CD73是其參與抑制機體免疫功能的機制之一。

綜上所述，宮頸癌患者外周血中MDSCs比例與腫瘤的發生發展相關，M-MDSCs的水平可能與患者病情進展相關，CD73是M-MDSCs發揮免疫抑制的重要分子之一。以上結果豐富了MDSCs發揮免疫抑制機制的研究，為進一步研究MDSCs在宮頸癌免疫抑制中的機制奠定基礎，并為宮頸癌的臨床診斷和免疫治療提供新的思路和方法。

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