丙谷二肽對γ射線致小鼠肺組織損傷的防護作用*

任雪玲，湯 寧，白 麗，陳 斌，李瑩輝，趙玉芬

1)鄭州大學藥學院 鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫院感染科 鄭州 450052 3)航天醫學基礎與應用國家重點實驗室 北京 100094 4)鄭州大學化學與分子工程學院河南省磷化工工程研究中心 鄭州 450052

60Co－γ射線等電離輻射源是臨床上常用的放療用射線，可用于肺癌及其他胸部腫瘤的放射治療[1]。然而，γ射線盡管具有較強的病變細胞殺死效應，但同時也會不可避免地引起機體正常組織和器官的損傷，不僅可對患者造成放射性損傷[2]，而且也會給受照醫護人員帶來一定程度的危害。因此如何減輕輻射損傷受到人們的日益關注。有研究[3]顯示，γ射線對肺組織和細胞的損傷主要是由于它可以促進活性氧自由基的生成，從而造成有機體生物分子斷裂、DNA 損傷。N(2)－L－丙氨酰－L－谷氨酰胺(丙谷二肽)是臨床上常用的一種營養藥物。據報道，丙谷二肽除可提高組織和細胞的免疫功能外[4]，還可以提高細胞內谷胱甘肽的含量，從而有效清除過氧化物[5]。作者先對小鼠進行丙谷二肽灌胃給藥，然后再進行γ射線全身照射，觀察小鼠肺組織輻射損傷變化情況，并分析肺組織中Bcl－2和Bax蛋白表達的變化，探討丙谷二肽對肺組織輻射損傷的防護作用及可能的機制，為臨床放射防護藥物的開發應用提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性昆明小鼠27只，體重(20±2)g，6～8周齡，由河南省實驗動物中心提供。丙谷二肽由廈門大學化學系提供。兔抗小鼠Bcl－2、Bax多克隆抗體購自Santa Cruz公司，β－actin鼠源單克隆抗體購自康成生物公司。Trizol、碘化丙啶(PI)、MTT等生化試劑購自創生科技有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。RIPA裂解液購自北京鼎國生物技術有限責任公司。FCC－8000型同心回轉式60Co治療機購自山東新華醫療器械股份有限公司，參數設定為源皮距80 cm，布野面積20 cm×20 cm，劑量1 Gy/min。

1.2 實驗分組 將27只小鼠隨機分為3組，分別為正常對照組、輻射組、丙谷二肽組，每組9只。丙谷二肽組灌胃給予丙谷二肽，給藥劑量1000 mg/kg，1次/d，連續7 d。第8天，輻射組、丙谷二肽組均給予4.0 Gy60Co γ射線照射，正常對照組不作處理。射線照射3 d后，將3組小鼠脫頸處死，收集有關臟器，進行相關指標的測定。

1.3 外周血白細胞總數檢測 小鼠脫頸處死前摘眼球眼眶取血，加入體積分數1%鹽酸，混勻后置于細胞計數板中進行白細胞計數，并按照以下公式換算成白細胞總數。白細胞總數(×109L－1)=細胞計數板中白細胞數÷4×稀釋倍數×107。

1.4 臟器指數測定 取脾臟、肺臟稱重，按照下列公式計算臟器指數。臟器指數=臟器重(mg)/體重(g)×100%。

1.5 肺組織學觀察和SOD活性測定 取出肺葉組織，生理鹽水清洗干凈后甲醛固定24 h，然后脫水、固定、切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察。分離小鼠肺臟，按照SOD試劑盒說明書操作，測定SOD活性。

1.6 肺組織細胞增殖和凋亡的檢測 ①將肺組織取出，剪碎并勻漿，200目濾網過濾得到單細胞懸液，過夜培養，加入MTT繼續培養4 h，加入二甲基亞砜溶解藍紫色結晶，測定570 nm波長處的吸光度(A)值。細 胞 增 殖 率 = [(A實驗組－ A空白)/(A正常對照組－A空白)]×100%。②將小鼠肺組織剪碎、勻漿濾網過濾后，PBS洗滌，用結合緩沖液重懸細胞，加入 5 μL FITC AnnexinV 和 5 μL PI染料，混合均勻后室溫避光放置15 min，上流式細胞儀檢測，使用ModFit LT for Mac V3.0軟件分析細胞凋亡率。

1.7 肺組織中 Bcl-2和 Bax蛋白的檢測 采用Western blot法檢測。向肺組織中加入RIPA裂解液，冰浴條件下勻漿提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，采用常規SDS－PAGE法進行垂直電泳、轉膜和封閉后，分別加入 Bcl－2一抗(稀釋1000倍)、Bax一抗(稀釋1000倍)或β－actin一抗(稀釋2000倍)4℃過夜孵育。TBST洗滌3次后加入二抗(稀釋5000倍)室溫孵育1 h。最后采用ECL化學發光法進行顯影、定影。用Quantity One圖像分析軟件分析條帶的光密度，以目的蛋白與β－actin條帶光密度的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 統計學處理 采用SPSS 10.0進行統計學分析。3組小鼠外周血白細胞總數、臟器指數、肺組織SOD活性、細胞凋亡率、Bcl－2和Bax蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析和LSD－t檢驗，輻射組和丙谷二肽組細胞增殖率和Bcl－2/Bax比值的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 組織學觀察 見圖1。正常對照組小鼠肺組織形態自然，間質少;輻射組小鼠肺組織出現異常，毛細血管通透性增加，血管內細胞滲出進入肺間質，肺泡壁增厚;丙谷二肽組小鼠肺組織學變化較輻射組有所減輕。

圖1 3組小鼠肺組織學表現(HE，×400)

2.2 3組小鼠外周血白血細胞總數、臟器指數、肺組織SOD活性的比較 見表1。由表1可知，與正常對照組相比，輻射組小鼠外周血白細胞總數、脾臟指數下降，肺臟指數升高，肺組織SOD活性降低。與輻射組比較，丙谷二肽組小鼠肺臟指數下降，肺組織SOD活性升高。

表1 3組小鼠白細胞總數、臟器指數和肺組織SOD活性的比較

2.3 3組小鼠肺組織細胞增殖率和凋亡率的比較丙谷二肽組細胞增殖率為(78.88±3.87)%，較輻射組的(57.25 ±11.63)% 提高(t=5.294，P ＜0.001);細胞凋亡率亦較輻射組降低，見表2。

2.4 3組小鼠肺組織中Bcl-2和Bax蛋白表達的比較 見圖2、表2。

圖2 3組小鼠肺組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達

表2 3組小鼠肺組織中細胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表達的比較

3 討論

胸部惡性腫瘤在進行放射性治療時，非常容易導致放射性肺損傷，臨床表現主要有肺充血，肺泡纖維蛋白滲出增多，甚至出現肺間質纖維化[6]。已有研究[7]表明，氧自由基的大量生成是放射性損傷的主要機制。SOD是一類廣泛存在于機體各種組織細胞內的金屬酶，主要用于清除超氧陰離子自由基;在輻射損傷的肺組織中，SOD活性與氧自由基水平呈負相關[8]。該研究中，輻射組小鼠肺組織呈放射性損傷改變，同時外周血白細胞總數、脾臟指數顯著下降，肺臟指數升高，肺組織SOD活性降低，說明該組小鼠存在放射性肺損傷。與輻射組小鼠比較，丙谷二肽組小鼠放射性肺損傷改變減輕，同時肺臟指數下降，肺組織SOD活性升高，提示丙谷二肽對γ射線照射導致的肺組織損傷確實有一定的防護作用。

氧自由基可以通過多種途徑誘導細胞凋亡[9－10]，從而對機體造成損傷。細胞凋亡的調控與兩類基因直接相關，分別是促凋亡基因和抑制凋亡基因，其中最具代表性的分別是 bcl－2 和 bax[11]，其表達產物Bax和Bcl－2蛋白可以形成同源或異源二聚體，在細胞凋亡的調控中發揮關鍵作用，因此有研究[12－13]稱 Bcl－2/Bax 比值是調控細胞凋亡的“分子開關”。該研究中，輻射組小鼠肺組織細胞凋亡率較正常對照組顯著升高，同時肺組織中Bcl－2蛋白的表達降低，而Bax蛋白表達升高，說明γ射線照射誘導了肺組織Bax和Bcl－2蛋白表達水平的改變，從而導致細胞凋亡的增加。與輻射組比較，丙谷二肽組小鼠肺組織細胞增殖率顯著提高，而凋亡率降低，小鼠肺組織中Bcl－2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，Bcl－2/Bax比值升高。這表明丙谷二肽有可能通過Bcl－2信號通路介導調控肺組織的細胞凋亡，從而實現對輻射致肺損傷小鼠肺組織的防護。但是，輻射損傷及其防護機制是一個涉及多基因、多通路的網絡系統，確切的機制還有待于進一步的深入研究。

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