白藜蘆醇對膀胱移行細胞癌T24細胞凋亡及組織蛋白酶B表達的影響*

馬曜輝，單中杰

1)新鄉醫學院 新鄉 453000 2)鄭州人民醫院泌尿外科 鄭州 450012

組織蛋白酶B(cathepsin B，CB)屬于木瓜蛋白家族，是溶酶體內最重要的組織蛋白酶，能夠降解各種組織蛋白[1]。CB除了參與重要的生理功能外還參與了多種腫瘤的生長、侵襲、凋亡過程[2-4]。白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種非黃酮類多酚化合物，在葡萄、花生、虎杖等藥用植物中廣泛存在。RES除了具有抗炎、抗氧化及神經保護等作用外[5]，近年來其抗腫瘤作用備受關注，可以促進多種腫瘤的凋亡。膀胱癌是泌尿系統最常見的腫瘤，90%以上為移行細胞癌。作者應用RES作用于人膀胱移行細胞癌T24細胞，觀察細胞凋亡和CB表達的變化，探討RES誘導T24細胞凋亡的機制，以期為膀胱癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 人膀胱移行細胞癌T24細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;RES(純度為99%)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，RES用DMSO配置成100 mmol/L的原液，－20℃保存備用。RPMI 1640培養基(武漢博士德生物工程有限公司);逆轉錄反應試劑盒(日本 Toyobo公司);CB和β-actin一抗(美國Abgent公司);Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司);RT-PCR引物(上海捷瑞生物工程有限公司);PCR儀(德國Eppendorf公司);流式細胞儀(德國Partec公司)。

1.2 T24細胞培養 人膀胱移行細胞癌T24細胞用含體積分數10%胎牛血清、1×105U/L青、鏈霉素的RPMI 1640培養基在37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養。隔天換液1次。2.5 g/L的胰蛋白酶消化、傳代細胞。

1.3 T24細胞凋亡的檢測 應用流式細胞術。收集對數生長期的T24細胞，將細胞消化并吹散制成細胞懸液，將細胞懸液加入6孔細胞培養板中。待細胞貼壁后，用含終濃度為25 μmol/L RES的培養基繼續培養24、48、72 h，以只含有培養基的細胞作為空白對照組，每組3個復孔。嚴格按照凋亡檢測試劑盒說明書操作。細胞分別用2.5 g/L的胰蛋白酶消化、離心，棄上清，重懸，加入 Annexin V-FITC避光孵育15 min，加入PI避光孵育5 min，30 min內流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.4 CB mRNA表達的檢測 采用RT-PCR法。分組同1.3，細胞培養 24、48、72 h 后用 Trizol法提取總RNA溶解于無RNA酶的水中。用酶標儀測定、計算各組提取總RNA的濃度及純度。按照逆轉錄反應試劑盒的說明書逆轉錄cDNA。采用由上海捷瑞生物工程有限公司合成的CB、β-actin引物，序列見表1。RT-PCR反應體系為20 μL，擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃45 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環;72℃終延伸10 min。配置20 g/L的瓊脂糖凝膠，取RT-PCR產物5 μL在80 V的恒壓下電泳30 min。用Alpha多功能成像系統采集圖像并分析圖像，以CB與β-actin電泳條帶積分光密度的比值表示CB mRNA的相對表達量。

1.5 CB蛋白表達的檢測 采用Western blot法。分組同1.3。用蛋白提取試劑盒提取實驗組及空白對照組24、48、72 h的T24細胞總蛋白。提取的蛋白采用BCA法進行蛋白濃度測定。測定后用裂解液將各樣本總蛋白的濃度進行配平，使各樣本總蛋白濃度相同。沸水3 min，蛋白變性;100 V 60 min，電泳;轉膜;封閉;洗膜;一抗孵育(CB按照1∶500稀釋，內參β-actin按照1∶1000稀釋)，4℃過夜;二抗孵育1 h;洗膜;高靈敏化學發光顯色，用Alpha多功能成像系統采集圖像并分析圖像，以CB與βactin光密度值的比值表示CB蛋白的相對表達量。

表1 引物序列

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，各組細胞凋亡率和CB表達的比較采用重復測量數據的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組T24細胞的凋亡情況 見表1。

2.2 各組T24細胞CB mRNA的表達 見圖1、表1。

圖1 各組細胞CB mRNA表達情況

2.3 各組T24細胞CB蛋白的表達 見圖2、表1。

圖2 各組細胞CB蛋白表達情況

表1 各組細胞凋亡、CB mRNA和蛋白表達情況(n=3)

3 討論

細胞凋亡是個極其復雜的過程，就目前的研究現狀，細胞凋亡途徑大致可分為外源性途徑(死亡受體凋亡途徑)和內源性途徑;內源性途徑又可以分為經典的線粒體凋亡途徑、內質網應激凋亡途徑[6]以及2006 年 Terman 等[7]提出的溶酶體線粒體軸凋亡途徑。溶酶體線粒體軸凋亡途徑指各種原因導致溶酶體膜不穩定，進而使溶酶體內的水解酶釋放，特別是半胱氨酸蛋白酶的釋放活化。溶酶體中最重要的是組織蛋白酶家族，CB又是其中最重要的一個。這些蛋白酶可以水解促凋亡蛋白，從而直接或間接地導致線粒體膜的通透性增加，使線粒體釋放大量的細胞色素C，細胞色素C與細胞質中的凋亡激酶活因子-1結合，啟動凋亡小體的形成[8]。凋亡小體活化Caspase家族中的Caspase-9結合，進而活化Caspase-3后裂解細胞底物，導致細胞凋亡[9]。在整個溶酶體線粒體軸凋亡途徑中溶酶體內的水解酶起著至關重要的作用。也有研究[10]表明，CB除了參與溶酶體線粒體軸凋亡途徑外，它還可以直接激活Caspase-9，啟動細胞凋亡。

RES是一種非黃酮類多酚化合物，最早從毛葉藜蘆中獲得[11]，隨后在多種中藥植物的根部均有發現，它主要是植物為對抗外界不良刺激分泌的保護劑。其具有抗氧化、抗炎、抗輻射、保護心血管等作用[5]，近年來其抗腫瘤作用備受關注，目前在肺癌[12]、肝癌[13]、胃癌[14]、前列腺癌[15]、腎細胞癌[16]等組織中均發現其可以促進腫瘤細胞的凋亡。但其作用機制目前被大家認可的一個是通過外源性凋亡途徑，外界刺激作用于特異性死亡受體，激活Caspase家族中的Caspase-8，繼而活化Caspase-3后裂解多種細胞底物，導致細胞凋亡;一個是經典的線粒體途徑，各種原因導致的線粒體通透性增加后，釋放細胞色素C，啟動形成凋亡小體[17-18]。

該研究觀察了RES對人膀胱移行細胞癌T24細胞凋亡的影響及CB mRNA和蛋白表達的變化，發現RES誘導的T24細胞的凋亡率隨時間的延長而升高;隨著細胞凋亡率的增加，CB mRNA和蛋白的表達均升高;提示CB可能參與了RES誘導的T24細胞的凋亡，其機制可能為RES作用于細胞后導致細胞溶酶體膜通透性改變，從而導致CB大量釋放于細胞質中。以上結果提示可以通過應用CB激活劑來進一步加速膀胱移行細胞癌細胞的凋亡。由于其整體的作用機制還不十分清楚，還需要進一步的研究，以期為臨床治療提供新的理論基礎。

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