索拉菲尼對肝星狀細胞活性及活化的影響*

王 林，李 波，耿智敏#，徐之超，陳 晨，李文智，鄭見寶

1)西安交通大學醫學院第一附屬醫院肝膽外科 西安 710061 2)西安交通大學醫學院第一附屬醫院普通外科 西安 710061

肝纖維化系指肝組織內細胞外基質(extracellualr matrix，ECM)過度增生與異常沉積，最終導致肝臟結構和功能異常的病理變化，進而發展為肝硬變[1]。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的持續激活是肝纖維化發生發展過程中的關鍵環節，抑制HSC活化、增殖成為目前阻斷、逆轉肝纖維化的重要策略。索拉菲尼作為一種多靶點、多激酶抑制劑靶向治療藥物，能明顯抑制HCC細胞增殖及血管新生[2]，但其對 HSC有無作用，此方面研究較少。該研究通過體外實驗觀察索拉菲尼對HSC活性及活化狀態的影響，為索拉菲尼治療肝纖維化提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人HSC細胞系(LX2)購自中南大學湘雅中心實驗室;索拉菲尼由拜耳公司饋贈，劑型200 mg/片，用體積分數100%DMSO溶解，－20℃保存。α-SMA兔抗人單抗購自美國Abcam公司，β-actin兔抗人單抗購自北京博奧森公司，ERK1/2兔抗人單抗、p-ERK1/2兔抗人單抗、AKT羊抗人單抗、p-AKT羊抗人單抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗等購自北京中杉金橋生物技術有限公司。TGF-β1和PDGF-BB ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1.2 細胞培養 LX2細胞在37℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，培養基為含體積分數10%胎牛血清的DMEM，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 MTT法測定索拉菲尼對LX2細胞的增殖抑制率 取LX2細胞，以5×104孔－1的密度接種于96孔板，培養24 h后加入索拉菲尼，藥物濃度分別為0(對照)、1、2、5、10、20、50 μmol/L，每種濃度設 3個復孔。加藥后分別培養12、24、36、48 h，然后每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續培養4 h，吸去原培養液，加入 DMSO 150 μL/孔，振蕩 10 min，用酶標儀(波長490 nm)測定每孔的A值，增殖抑制率=(對照組A值－實驗組A值)/對照組A值×100%。

1.4 免疫細胞化學法檢測LX2細胞α-SMA的表達 ①細胞爬片:取LX2細胞，制成細胞懸液，調整細胞密度為(1～5)×105mL－1。移液器吸取細胞懸液500 μL，分別接種于5組蓋玻片上。培養箱孵育4 h，移液器輕輕移去培養液，對照組加1 mL培養液，實驗組分別加入1 mL 含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培養液，培養箱內孵育24 h。②免疫細胞化學染色:40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，體積分數3%H2O2封閉10 min，PBS洗3遍，山羊血清封閉(室溫下1 h)，甩去山羊血清，加入α-SMA一抗，4℃冰箱過夜。PBS洗3遍，加ABC復合物，室溫下30 min～1 h，DAB顯色，蘇木素復染，自來水沖洗，自然風干后，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察α-SMA表達情況，并于400倍鏡下選取6個視野進行計分。陽性細胞百分比計分:按照陽性細胞占所有細胞的比例計分，0、＜25%、25% ～、50% ～、75% ～分別為0、1、2、3、4 分。著色強度計分:細胞無著色，0分;淺黃色，1分;棕黃色，2分;棕褐色，3分。2項評分結果相加，0分為陰性(－)，1～分為弱陽性(+)，4～分為中等陽性(?)，6～7分為強陽性(?)。各組分別設置4個復孔。

1.5 ELISA 法檢測 TGF-β1和 PDGF-BB 實驗組使用含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培養液，對照組用未加索拉菲尼的單純培養液。分別干預LX2細胞12、24、36 h后，提取上清，使用 ELISA試劑盒檢測上清中TGF-β1和PDGF-BB的水平。各組分別設置5個復孔。

1.6 Western blot檢測 AKT/p-AKT 和 ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2取LX2細胞，培養液分別為未添加索拉菲尼和含索拉菲尼1、2、5、10 μmol/L的培養液。培養0.5 h后，倒棄培養液，添加400 μL裂解液，置于冰盒上1 h，離心提取蛋白，蛋白定量后上樣20 μL，行Western blot檢測各組不同蛋白表達情況。實驗內參為β-actin。每組重復3次。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0進行數據分析。采用析因設計的方差分析比較各組LX2細胞增殖抑制率、上清 TGF-β1和PDGF-BB水平的差異，各組α-SMA表達情況的比較采用Kruskual-Wallis多組等級資料的秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 索拉菲尼對LX2細胞增殖能力的影響 結果見表1。

2.2 免疫細胞化學染色法檢測LX2細胞α-SMA的表達 對照組均有α-SMA表達，1、2、5 μmol/L實驗組均有α-SMA表達，但10 μmol/L組幾乎無正常形態細胞，α-SMA表達也明顯減弱。見圖1和表2。

2.3 ELISA 法檢測 TGF-β1與 PDGF-BB 結果見表 3、4。

表1 各組LX2細胞的增殖抑制率比較(n=3) %

圖1 索拉菲尼作用24 h后LX2細胞α-SMA表達情況(SABC，×100)

表2 各組LX2細胞α-SMA表達情況(n=24)視野

表3 各組上清TGF-β1水平(n=5) μg/L

表4 各組上清PDGF-BB水平(n=5) ng/L

2.4 Western blot檢測結果 見圖2。可知，各組ERK1、ERK2、AKT 蛋白表達量基本相同，10 μmol/L組 p-AKT、p-ERK1、p-ERK2蛋白表達降低。

圖2 各組AKT/p-AKT和ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2蛋白表達情況

3 討論

索拉菲尼屬于分子靶向治療新藥，是一種多靶點、多激酶抑制劑，在抑制肝癌細胞方面已取得重大進展。其作用機制主要為2個方面[2-3]:①通過阻斷MAPK通路抑制腫瘤細胞增殖。②通過阻斷VEGF受體和PDGF受體，抑制腫瘤血管生成。近年來研究[4-5]發現，索拉菲尼除了可抑制上皮癌細胞的增殖外，還可調節鄰近間質細胞的受體酪氨酸激酶信號通路。

活化的HSC是肝纖維化發生時ECM的主要來源[6]。已有研究[7]表明，索拉菲尼用于門靜脈高壓癥可顯著改善血流動力學、抑制新生血管形成、減輕肝臟的纖維化，明顯降低門靜脈壓力。索拉菲尼是否可以抑制HSC的活性及活化，繼而阻斷、逆轉肝纖維化，該實驗對此進行了研究。

實驗發現，索拉菲尼可抑制LX2細胞活性，還發現藥物濃度越高索拉菲尼的抑制作用越明顯，且隨著時間的延長索拉菲尼的抑制作用表現得也越明顯。但在48 h時，LX2細胞活性有所恢復，考慮與索拉菲尼藥代動力學因素有關。故隨后實驗作者選用的藥物濃度為 1、2、5 和 10 μmol/L，作用時間為12、24 和36 h。

實驗中以不同濃度索拉菲尼干預LX2細胞12、24和36 h后，發現其作用機制表現為以下幾方面:①索拉菲尼抑制LX2細胞的活化，而α-SMA的表達為HSC活化的標志，活化的HSC是肝纖維化發生和發展的核心環節。免疫細胞化學法檢測α-SMA的表達時發現，對照組和實驗組中α-SMA的表達有差異，證明索拉菲尼可抑制LX2細胞活化。②索拉菲尼可抑制LX2細胞分泌某些細胞活性因子，包括PDGF-BB和TGF-β1。細胞因子分泌作為HSC活化重要特征之一，主要表現在TGF-β1、PDGF-BB等大量分泌。該實驗通過ELISA法檢測不同水平索拉菲尼干預下提取的LX2細胞上清中PDGF-BB、TGF-β1的表達量發現，隨著藥物水平的升高，PDGF-BB和TGF-β1在上清中的水平呈遞減趨勢，而同一藥物水平下，隨著時間的延長，PDGF-BB和TGF-β1也呈遞減表達，進而達到抑制LX2細胞活化的目的。③索拉菲尼通過抑制LX2細胞的PDGF信號通路，從而抑制其活化。該實驗通過Western blot方法檢測Ras/ERK通路中ERK1/ERK2和p-ERK1/p-ERK2以及PI3K通路中AKT和p-AKT的變化，可評估索拉菲尼對PDGF信號通路的影響。作者發現對照組和實驗組ERK1/ERK2及AKT表達水平基本相同，而其相應的磷酸化狀態，實驗組表達逐漸減弱，說明索拉菲尼可抑制PDGF信號通路中ERK1/ERK2及AKT的磷酸化，阻斷了PDGF細胞通路的正常傳導，從而抑制LX2細胞的活化、增殖。

綜上，該研究初步證實索拉菲尼可下調HSC上清液中PDGF-BB和TGF-β1的分泌，抑制 PDGF信號通路，最終抑制HSC的活化及活性，為索拉菲尼治療肝纖維化提供了新的理論依據。

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