高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定鹽酸馬尼地平片中鹽酸馬尼地平的含量

宋群立，王 蕾，郝永偉，張超峰，史進(jìn)進(jìn)，張紅嶺#

1)許昌幼兒師范學(xué)校 許昌 461700 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

鈣通道拮抗劑[1-3]是一種重要的、臨床常用的心血管治療藥物，廣泛用于冠心病、心絞痛、高血壓、心律失常、心力衰竭等的臨床治療。目前臨床常用的鈣通道阻滯劑主要有兩種，分別為二氫吡啶類和非二氫吡啶類。鹽酸馬尼地平為二氫吡啶類鈣通道拮抗劑，對(duì)心臟無抑制作用，不影響心率，具有一定抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用，不良反應(yīng)少，對(duì)于高血壓合并2型糖尿病或者糖耐量降低的患者以及老年患者均有良好的降壓作用[4]。目前，測(cè)定鹽酸馬尼地平含量的方法有HPLC法[5-6]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[7-8]。與上述方法相比，毛細(xì)管電泳法具有不使用有機(jī)溶劑、經(jīng)濟(jì)、高效分離等優(yōu)點(diǎn)，目前在藥物制劑、蛋白質(zhì)及食品的分析檢測(cè)中已廣泛應(yīng)用。作者建立了采用高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定鹽酸馬尼地平片中鹽酸馬尼地平含量的方法，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)Beckman公司)，熔融石英毛細(xì)管(河北永年光導(dǎo)纖維廠)，Starter 3C酸度計(jì)與CP214分析天平(美國(guó)奧豪斯公司)，超純水器(美國(guó)Millipore公司)。鹽酸馬尼地平對(duì)照品(純度 ＞99.0%，批號(hào):20110218)、內(nèi)標(biāo)物苯磺酸氨氯地平對(duì)照品(純度＞99.0%，批號(hào):20110309)均購(gòu)自湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司，鹽酸馬尼地平片(10 mg/片，鄭州大學(xué)新藥研究中心提供，批號(hào):20110625、20110709、20110728)，實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純，緩沖液和樣品溶液配制用水均為超純水。

1.2 所需溶液的制備 ①運(yùn)行緩沖液:稱取無水醋酸鈉1.23 g，溶于500 mL超純水中，得到30 mmol/L醋酸鈉溶液，用1 mol/L醋酸溶液調(diào)節(jié)pH為4.5。②對(duì)照品溶液:精密稱取鹽酸馬尼地平對(duì)照品適量，加水定容于100 mL容量瓶中，配成1.0 g/L對(duì)照品溶液。③內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取苯磺酸氨氯地平適量，加水定容于100 mL容量瓶中，配成1.0 g/L內(nèi)標(biāo)溶液。④樣品溶液:取供試品鹽酸馬尼地平片3批，每批20片，精密稱重，置干燥潔凈的研缽中研磨均勻，精密稱取適量(約相當(dāng)于鹽酸馬尼地平10 mg)，各3份，置100 mL容量瓶中，加適量水充分溶解，再加水定容至刻度，搖勻，以0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液即為供試品溶液。

1.3 電泳條件 以熔融石英毛細(xì)管柱(45 cm×75 μm，有效長(zhǎng)度 37 cm)為固定相，壓力進(jìn)樣(3.4 kPa×5 s)，工作電壓 25 kV，柱溫 25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm，運(yùn)行緩沖液:30 mmol/L醋酸鹽緩沖液(pH 4.5)。每次運(yùn)行前用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、超純水、運(yùn)行緩沖液依次沖洗毛細(xì)管5、3、3 min，2次運(yùn)行之間以緩沖液沖洗3 min。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對(duì)照品溶液 0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，置 10 mL容量瓶中，各加入內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，加水定容至刻度，搖勻，得到含內(nèi)標(biāo)物0.1 g/L，對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為 0.025、0.050、0.100、0.150、0.200、0.250 g/L的溶液;按1.3中實(shí)驗(yàn)條依次進(jìn)樣，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(g/L)為X軸，對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為Y軸，進(jìn)行線性回歸。

1.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液、內(nèi)標(biāo)溶液各1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成0.1 g/L對(duì)照品溶液(內(nèi)標(biāo)濃度0.1 g/L)，按1.3中實(shí)驗(yàn)條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖并計(jì)算對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值及遷移時(shí)間。

1.4.3 最低檢測(cè)限與最低定量限 分別取信噪比為3∶1時(shí)鹽酸馬尼地平溶液的質(zhì)量濃度為最低檢測(cè)限，取信噪比為10∶1時(shí)鹽酸馬尼地平的質(zhì)量濃度為最低定量限。

1.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)已知含量的鹽酸馬尼地平片20片，精密稱量，計(jì)算平均片重，置研缽中研磨均勻，精密稱取該粉末9份(相當(dāng)于平均片重)，置于100 mL容量瓶中，分別精密加入鹽酸馬尼地平對(duì)照品適量、內(nèi)標(biāo)溶液10 mL，加入適量水充分溶解，再加水定容至刻度，混勻，以0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，按1.3中實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣檢測(cè)。

1.5 樣品含量測(cè)定 分別精密吸取不同批號(hào)的樣品溶液4.0 mL及內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度。按1.3中實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 毛細(xì)管電泳圖 見圖1。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果 該法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=12.086X+0.00689，r=0.9994。由此可知，在內(nèi)標(biāo)濃度為0.1 g/L時(shí)，馬尼地平含量在0.025～0.250 g/L時(shí)線性關(guān)系良好。馬尼地平的最低檢測(cè)限為0.0025 g/L，最低定量限為 0.008 g/L。精密度實(shí)驗(yàn)中，峰面積比RSD為1.67%，遷移時(shí)間RSD為0.79%。加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

圖1 對(duì)照品(A)及樣品(B)毛細(xì)管電泳圖

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品含量測(cè)定結(jié)果 3批樣品馬尼地平相對(duì)標(biāo)示含量分別為 99.32%、99.28%、99.57%。

3 討論

緩沖液的pH值對(duì)樣品峰的分離有較大的影響。溶液pH值對(duì)毛細(xì)管表面特性及柱壁與溶質(zhì)的電荷差異有較大影響，可改變其相互作用，影響各峰之間的分離度。實(shí)驗(yàn)考察多種 pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、6.0)對(duì)分離度的影響，結(jié)果表明，隨著緩沖液pH值的增高，電滲流增大，樣品的保留時(shí)間縮短，但峰形亦隨之變差。綜合考慮后，選用pH值為4.5的醋酸鹽緩沖液，樣品分析時(shí)間短，且有較好的分離度。

分離電壓主要對(duì)分離度和分析時(shí)間產(chǎn)生影響。當(dāng)分離電壓增加，毛細(xì)管軸向的電場(chǎng)強(qiáng)度同時(shí)增強(qiáng)，柱效增大，分離時(shí)間縮短。分別選擇分離電壓15、20、25 kV進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，25 kV時(shí)遷移時(shí)間短，同時(shí)鹽酸馬尼地平和苯磺酸氨氯地平有較好的分離度。

緩沖液的濃度在一定程度上影響峰形和遷移時(shí)間。隨著離子濃度增大，電滲流減小、遷移時(shí)間延長(zhǎng)、色譜峰變寬。分別選擇30、50、70 mmol/L的醋酸鹽緩沖液，當(dāng)緩沖液濃度為30 mmol/L時(shí)，電流較小，產(chǎn)生的熱較小，馬尼地平和氨氯地平能得到較好的分離。

加入內(nèi)標(biāo)可提高毛細(xì)管電泳的準(zhǔn)確度。該研究結(jié)果顯示，加入內(nèi)標(biāo)后，回歸方程線性相關(guān)系數(shù)r=0.9994，RSD=1.67%。

該方法和HPLC[2]法相比，具有樣品保留時(shí)間短、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)。該方法樣品保留時(shí)間為3 min;HPLC法樣品保留時(shí)間為11 min。此外，樣品制備及分析過程中，HPLC法用到有機(jī)溶劑，污染大，該方法未用到有機(jī)溶劑，更加環(huán)保。

總之，該方法簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性好，可用于鹽酸馬尼地平片中鹽酸馬尼地平含量的測(cè)定。

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