臍血干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化效果觀察*

梁 麗，顧福嘉，黃國美#，楊大平，張玲玲，袁 軍

1)貴州省人民醫(yī)院消化內(nèi)科 貴陽 550002 2)貴州省人民醫(yī)院介入科 貴陽 550002 3)貴州省人民醫(yī)院中心實驗室 貴陽 550002

肝硬化是一種世界性的醫(yī)療衛(wèi)生難題，該病在 我國發(fā)病率及病死率均較高，尤其是Child C級的失代償期肝硬化，易并發(fā)多種并發(fā)癥，患者生活質(zhì)量低，目前尚無行之有效的治療措施[1]。原位肝移植理論上是惟一有效的治療措施，然而存在供體少、手術(shù)并發(fā)癥多、排斥反應(yīng)及費用高等諸多問題[2]。近年來，隨著干細(xì)胞研究的興起，國內(nèi)外已有用干細(xì)胞移植治療肝病的報道[3-5]。干細(xì)胞移植可促進(jìn)肝細(xì)胞再生，改善肝功能[6]，且干細(xì)胞移植具有損傷小、并發(fā)癥少、費用低廉、取材方便的特點，因此，干細(xì)胞移植有望為終末期肝病的治療提供一種新的選擇。貴州省人民醫(yī)院于2009年5月至2012年5月利用負(fù)篩選混合法分離、純化臍血干細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定后在數(shù)字減影血管造影(DSA)指導(dǎo)下，于肝固有動脈過繼回輸治療Child C級失代償期肝硬化患者，現(xiàn)對該治療方法的療效、安全性總結(jié)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2009年5月至2012年5月收治的30例失代償期肝硬化患者，其中男22例，女8例，年齡39～76(57.0±3.9)歲。30例均為 Child C級，其中并發(fā)大量腹水21例，中度黃疸5例，肝性腦病3例，上消化道出血6例。30例中乙肝后肝硬化7例，酒精性肝硬化14例，乙肝與酒精混合性肝硬化5例，膽汁淤積性肝硬化2例，原因不明2例。所有病例進(jìn)行干細(xì)胞移植治療前均給予傳統(tǒng)控制水鈉攝入、保肝、糾正低蛋白血癥等內(nèi)科綜合治療2周，效果不佳，干細(xì)胞移植治療前肝功能各項指標(biāo)[包括血清白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TB)、凝血酶原時間(PT)等指標(biāo)]均異常，Child分級仍然為C級，21例大量腹水患者B超測量腹水深度＞10 cm。所有患者干細(xì)胞移植治療前均進(jìn)行知情告知，并自愿簽署知情同意書。

1.2 臍血干細(xì)胞的采集、分離、純化及鑒定 臍血采集自貴州省人民醫(yī)院產(chǎn)科分娩的健康產(chǎn)婦，排除病毒性肝炎、艾滋病、梅毒等傳染病者，無病理妊娠。胎兒娩出后斷臍，消毒采血部位，用裝有保存液的一次性采血袋以封閉式采血法采血，每袋采集臍血約150 mL。該研究已經(jīng)獲醫(yī)院倫理委員會審核通過。采取臍血前對所有產(chǎn)婦進(jìn)行知情告知，產(chǎn)婦均自愿簽署知情同意書。骨髓、臍血有核細(xì)胞體外分離試劑盒購自中國中航(寧夏)生物有限責(zé)任公司。用負(fù)篩選混合法分離、純化臍血干細(xì)胞(嚴(yán)格按照試劑盒說明操作)，臺盼蘭染色，計數(shù)，觀察純化細(xì)胞的活性。熒光標(biāo)記抗體CD45-PE和CD34-PerCP購自BD公司，細(xì)胞被抗體標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀檢測。將細(xì)胞活性在95%以上、數(shù)量在1×107以上的干細(xì)胞用生理鹽水5 mL制成細(xì)胞懸液。

1.3 治療方法

1.3.1 術(shù)前準(zhǔn)備 所有病例于術(shù)前行肝功能、凝血功能、甲胎蛋白(AFP)、腹部B超、肝臟CT+門脈CTA檢查以及肝炎病毒、HIV病毒、梅毒等病原體檢查，除外惡性腫瘤、其他重要臟器功能衰竭等禁忌證，并經(jīng)內(nèi)科綜合治療糾正肝性腦病、消化道出血、感染等并發(fā)癥。

1.3.2 臍血干細(xì)胞移植 在DSA下經(jīng)股動脈穿刺插管，置管于肝固有動脈，造影觀察肝內(nèi)血管情況，進(jìn)一步除外肝臟占位病變。將分離提純的臍血干細(xì)胞混懸液立即經(jīng)導(dǎo)管從肝固有動脈灌注于肝臟，生理鹽水10 mL沖管。術(shù)畢拔管，穿刺點加壓包扎后返回病房，術(shù)側(cè)下肢制動24 h，監(jiān)測生命體征。

1.3.3 術(shù)后處理 所有患者術(shù)后僅給予常規(guī)保肝治療，不輸注白蛋白。

1.4 療效觀察 術(shù)后1周、2周、4周、8周、12周、半年及1 a隨訪，觀察癥狀、體征及不良反應(yīng)發(fā)生情況，并行肝功能、凝血功能、血常規(guī)、上腹部B超等相關(guān)檢查。腹水控制效果以腹圍、體重及B超測量腹水深度進(jìn)行評價。腹圍縮小＜5 cm為輕度縮小，5～cm為中度縮小，≥10 cm為明顯縮小。體重減輕＜2.5 kg為輕度減輕，2.5～ kg為中度減輕，≥5 kg為明顯減輕。腹水深度減少＜5 cm為腹水輕度減少，5～cm為中度減少，≥10 cm為明顯減少。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。不同時間點肝功能各項指標(biāo)的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 臍血干細(xì)胞的鑒定 每袋臍血經(jīng)試劑盒分離純化后至少可得數(shù)量在1×107以上的干細(xì)胞;光鏡下可見細(xì)胞呈圓形，折光性強(qiáng)(圖1);細(xì)胞活性在95%以上;經(jīng)鑒定，分選后獲得CD45+CD34－干細(xì)胞群。

圖1 分離純化的臍血干細(xì)胞光鏡下表現(xiàn)(×200)

2.2 癥狀與體征的改善情況 30例患者均于移植術(shù)后1周腹脹、乏力、納差等癥狀好轉(zhuǎn)，體力及精神狀況開始恢復(fù)，術(shù)后4周癥狀明顯改善。

2.3 肝功能情況 見表1。臍血干細(xì)胞移植術(shù)后2周，患者ALB水平開始明顯升高，并呈持續(xù)升高趨勢。血清ALT水平于術(shù)后2周開始下降，術(shù)后12周時19例患者恢復(fù)正常，術(shù)后半年25例恢復(fù)正常。患者血清TB水平于術(shù)后1周開始下降，術(shù)后12周以后下降明顯;5例術(shù)前TB＞150 μmol/L的患者中有4例于術(shù)后半年恢復(fù)正常。術(shù)后PT逐漸接近正常。

表1 患者治療前后不同時間點肝功能各項指標(biāo)測定結(jié)果(n=30)

2.4 腹水情況 術(shù)前對于有頑固性腹水的21例患者給予白蛋白輸注，但腹水控制不佳，白蛋白水平上升不穩(wěn)定。干細(xì)胞移植術(shù)后腹水恢復(fù)情況見表2。術(shù)后1周患者尿量增加，腹脹癥狀明顯緩解，腹圍縮小，體重減輕。B超結(jié)果顯示，術(shù)后12周時16例腹水消失;術(shù)后半年時2例腹水輕度減少，2例腹水中度減少，但有反復(fù)，需間斷輸注白蛋白，其余患者腹水明顯減少或消失，且表現(xiàn)穩(wěn)定。

表2 干細(xì)胞移植術(shù)后21例頑固性腹水患者腹水情況 例

2.5 治療后Child分級情況 30例術(shù)前肝功能均為C級。術(shù)后半年9例恢復(fù)至Child A級，17例恢復(fù)至Child B級，4例仍為Child C級。術(shù)后1 a，15例恢復(fù)至Child A級，12例為Child B級，3例仍為Child C級。

2.6 不良反應(yīng)情況 術(shù)中30例患者均未出現(xiàn)出血、感染等并發(fā)癥。術(shù)后均未發(fā)生發(fā)熱、皮疹、嘔吐、感染、疼痛、出血等與治療相關(guān)的不良反應(yīng)，患者耐受性較好。

3 討論

干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化能力的細(xì)胞，可定向分化為功能細(xì)胞并用于器官損傷的修復(fù)。骨髓/臍血干細(xì)胞均是肝細(xì)胞的重要肝外來源，可在肝臟微環(huán)境下經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化為功能成熟的肝細(xì)胞，參與肝臟結(jié)構(gòu)功能的修復(fù)和重構(gòu)，能有效改善肝功能[7-9]，可為原位肝移植提供等待時間，甚至可使部分失代償期患者恢復(fù)至代償期。骨髓干細(xì)胞應(yīng)用于臨床較早，但抽吸骨髓為有創(chuàng)性操作。Child C級失代償期肝硬化多為老齡患者，且多伴嚴(yán)重并發(fā)癥(如頑固性腹水、凝血功能障礙、肝性腦病、中重度黃疸等)，難以耐受150～200 mL骨髓收集術(shù)，因此該類患者對于骨髓干細(xì)胞治療依從性差。臍血干細(xì)胞移植取材方便，干細(xì)胞來源豐富，不額外增加終末期肝硬化患者的痛苦及治療風(fēng)險，無移植后排斥反應(yīng)，更易于被患者接受。此外，研究[10]表明，與骨髓干細(xì)胞和外周血干細(xì)胞比較，臍血干細(xì)胞自我繁殖能力更強(qiáng)，干細(xì)胞得率也更大。因此，臍血干細(xì)胞是良好的潛在的細(xì)胞治療源。

負(fù)篩選混合法是一種高效、可行的分離純化干細(xì)胞的方法，其原理是在蛋白酶選擇性地與非靶細(xì)胞結(jié)合后，通過密度梯度離心分離獲得所需的靶細(xì)胞。由于是負(fù)篩選，所以收集的靶細(xì)胞沒有被標(biāo)記，回收的干細(xì)胞數(shù)量多、活性高，能完整保留生物學(xué)活性[10]。作者利用負(fù)篩選混合法分離、純化臍血干細(xì)胞，可以從150 mL臍血中分離出1×107以上個干細(xì)胞，細(xì)胞活性可達(dá)95%以上。上述結(jié)果提示:負(fù)篩選混合法獲得的臍血干細(xì)胞純度高，數(shù)量及活性穩(wěn)定，達(dá)到了細(xì)胞移植治療的要求。

干細(xì)胞移植途徑包括門靜脈、股動脈、肝內(nèi)注射、脾內(nèi)、外周靜脈、腹腔等，每種途徑都有自己的優(yōu)缺點，其中，在DSA指導(dǎo)下置管于肝固有動脈灌注干細(xì)胞的途徑被較多地應(yīng)用于臨床，這樣可以使干細(xì)胞能更有效地到達(dá)肝臟。該研究中30例患者均在DSA指導(dǎo)下，通過股動脈插管至肝固有動脈行干細(xì)胞灌注移植，術(shù)中、術(shù)后所有患者均未出現(xiàn)出血、局部血腫、感染等并發(fā)癥。

Lyra等[11]對30例肝硬化失代償期患者實施骨髓干細(xì)胞移植治療，在移植術(shù)后第90天患者血漿白蛋白升高，Child評分改善。該研究術(shù)后定期隨訪的結(jié)果顯示:臍血干細(xì)胞移植術(shù)后1周左右，多數(shù)病例乏力、納差、腹脹等癥狀開始改善，術(shù)后4周左右癥狀明顯緩解。該組患者ALB升高發(fā)生最早且明顯，頑固性腹水的控制效果顯著。臍血干細(xì)胞移植術(shù)后半年，9例患者肝功能恢復(fù)至Child A級，17例恢復(fù)至Child B級;術(shù)后1 a，15例恢復(fù)至Child A級，12例為Child B級。上述結(jié)果提示:經(jīng)肝固有動脈過繼回輸臍血干細(xì)胞是一種潛在、有效的治療Child C級終末期肝硬化的手段。

綜上所述，過繼回輸負(fù)篩選混合法分離、純化的臍血干細(xì)胞是一種具有巨大臨床治療潛能的、安全有效的治療Child C級失代償期肝硬化的方法。但此次研究病例數(shù)及觀察時間有限，因此該治療方法的中遠(yuǎn)期療效還有待進(jìn)一步總結(jié);干細(xì)胞治療的最佳途徑、時機(jī)如何，治療的穩(wěn)定性如何，是否需要重復(fù)治療等還需要進(jìn)一步的研究總結(jié)。

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