超聲波協同酶法提取荔枝殼中總黃酮及抗氧化性

阮尚全, 宋秋菊, 何慧蓉, 張 裕, 羅大英, 蘭子平*

（1.內江師范學院 化學化工學院,四川 內江641112；2.內江師范學院 四川省高等學校果類廢棄物資源化重點實驗室,四川內江641112）

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）為無患子科荔枝屬常綠喬木,是熱帶和亞熱帶的特色水果,主要分布于我國廣東、廣西、福建、臺灣以及四川的合江縣等地區.合江荔枝產量占四川全省的90%以上,2012年產量已達1 100多萬kg.荔枝殼為荔枝的外果皮,含有如花青素、紅色素、黃酮類、酚酸和多糖類等多種活性成分,具有很高的藥用價值［1］.黃酮是廣泛存在于植物細胞內的細胞次生代謝、具有酚羥基的化合物,由于其自身被氧化而具有抗氧化作用,在體內和體外都具有較強的抗氧化性,對人的毒副作用小,因而受到了國內外學者的高度重視［2-3］.纖維素酶能催化破壞細胞壁,改變細胞壁的通透作用,利于細胞內含物滲出,同時其具有專一性,不破壞其他物質,保持其他物質的原生結構,因此與傳統提取方法相比,具有無毒、反應條件溫和及催化活力可調控制等優勢,在植物成分的提取中得到了廣泛應用［4］；超聲波在介質中傳播時產生的空化作用、機械效應、熱效應、化學效應,可提高目標物從固相轉移到液相的傳質速率,提高提取產率,同時不影響大多數有效成分的生理活性［5-6］.本文將纖維素酶和超聲波的優點相結合,以四川合江縣產的荔枝殼為原料,建立荔枝殼中黃酮提取的新方法,并對提取物清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力進行了初步實驗,對提高荔枝殼的綜合利用價值具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要儀器 T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析）、KQ-400KDB超聲波清洗器（江蘇昆山）、TD-5臺式低速離心機（四川蜀科）、DFT-100型中藥粉碎機（溫嶺）、電熱鼓風干燥箱（重慶銀河）、AE240電子分析天平（梅特勒-托利多）、HH-S2恒溫水浴鍋.

1.1.2 試劑 纖維素酶（11 kU/G）,蘆丁（BR）,三羥甲基氨基甲烷（BR）,亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉等均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝流程 荔枝殼清洗→烘干粉碎→溶劑浸泡酶解→超聲提取→分離顯色→測定.

1.2.2 黃酮的提取與測定 試驗用荔枝殼采自于四川合江縣,材料洗凈低溫烘干、粉碎.準確稱取一定量荔枝殼粉于提取瓶中,按照一定固液比加入乙醇和纖維素酶酶解,在一定的溫度下超聲提取,離心分離上層清液定容,按照文獻［7］方法測定吸光度值,根據標準曲線回歸方程得到提取液濃度,計算總黃酮提取率.

1.2.3 蘆丁標準曲線的繪制 準確稱取0.020 0g蘆丁標準品溶解于體積分數30%的乙醇中,定容于100 mL容量瓶中,得到0.20 mg/mL標準液.準確移取標準液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL 于25 mL 比色管,按文獻［7］方法加入質量分數5%的NaNO2溶液1.0 mL,6 min后加入質量分數10%的硝酸鋁溶液1.0 mL,放置6 min,加質量分數4%NaOH溶液10.0 mL,用蒸餾水定容,在511 nm處測定吸光度,繪制標準曲線.

1.2.4 單因素實驗 準確稱取荔枝殼粉1.000 g于100 mL提取瓶中,做以下因素試驗:固定料液比為1∶30、pH5、0.06%的纖維素酶、50℃酶解 80 min、280 W超聲波提取20 min條件,乙醇體積分數分別為10%～80%；固定乙醇體積分數為40%、0.06%的纖維素酶、pH5、50℃酶解80 min、280 W超聲波提取20 min條件,料液比分別為1∶20～1∶80；固定乙醇體積分數為40%、料液比1∶30、pH5、50℃浸泡80 min、280 W超聲波提取20 min條件,纖維素酶用量分別為0.00%～0.30%；固定乙醇體積分數為40%、料液比1∶30、0.06%的纖維素酶、pH5、酶解80 min、280 W超聲波提取20 min條件,酶解溫度為30～70℃；固定乙醇體積分數為40%、料液比1∶30、0.06%的酶用量、pH5、280 W超聲波提取20 min條件,50℃酶解20～80 min；固定乙醇體積分數為40%、料液比1∶30、0.06%的纖維素酶、50℃酶解80 min、280 W超聲波提取20 min條件,pH值分別為3～7；固定乙醇體積分數為40%、料液比1∶30、0.06%的纖維素酶、pH5、50℃恒溫酶解80 min、超聲波提取20 min條件,超聲波功率分別為160～400 W.

1.2.5 抗氧化性實驗 對·OH清除能力采用水楊酸法,參照文獻［8］方法,在反應體系中加入荔枝殼提取物,利用H2O2與Fe2+混合產生·OH,在反應體系中加入水楊酸有效地捕捉·OH產生有色產物,產物在510 nm波長處測定其吸光度.O2-·清除的實驗采用鄰苯三酚自氧化法,參照文獻［9］利用鄰苯三酚在弱堿性條件下自身氧化產生O2-.和有色中間產物,在反應體系中加入荔枝殼提取物,O2-·的生成受到抑制,鄰苯三酚自氧化受阻,在420 nm波長處測定其吸光度.

2 結果與討論

2.1 標準曲線實驗結果實驗測得標準曲線回歸方程為:吸光度 A ＝0.0114c-0.0019,c/（μ g/mL）為蘆丁質量濃度,復相關系數R2＝0.9993,蘆丁質量濃度在8.0～56.0 μ g/mL范圍內線性關系良好,如圖1所示.

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的升高而增加,乙醇體積分數為50%時達到最高,隨后逐漸降低.這是由于黃酮溶解于乙醇,乙醇體積分數增大利于黃酮的溶出,致提取率增大.但過高的乙醇體積分數使體系介質發生的改變可能降低了超聲波功能作用,致使黃酮的提取率降低,如圖2所示.

2.2.2 料液比對黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的升高而增加,料液比為1∶60時達到最高,隨后變化不大,如圖3所示.

2.2.3 酶用量對黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著酶用量的升高而增加,在酶用量為0.12%時達到最高,隨后逐漸降低.原因是纖維素酶破壞原料的細胞壁,讓黃酮更易擴散到溶劑中,以提高提取率；過高的酶量會使總黃酮的提取率減小,這是由于底物配比對酶解作用有較大的影響,同時纖維素酶的加入也會加大大分子物質（如:果膠等）的溶出,對黃酮產生吸附,致總黃酮得率降低,如圖4所示.

2.2.4 酶解溫度對黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨溫度的升高而增加,溫度為60℃時最高,隨后逐漸降低.這是由于溫度越高,對原料作用越充分,提取率提高；而酶有一個最適作用溫度,當溫度過高時,酶的活性會降低,黃酮也會分解,故提取率降低,如圖5所示.

2.2.5 酶解時間對酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著酶解時間的增加而增加,酶解時間為80 min時提取率最高,然后逐漸降低.原因是提取時間增長,有利于黃酮的溶出,提取率增大；但過長的時間也會導致黃酮氧化分解,且乙醇也會揮發,導致黃酮提取率會降低,如圖6所示.

2.2.6 酶解pH值對黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著pH升高而增加,pH＝5時最大,隨后逐漸降低.是由于纖維素酶的活性受pH影響,在黃酮提取過程中pH值為5時是纖維素酶的最適酸度,pH值過低和過高時,酶的活性會逐漸降低,故黃酮提取率會也會隨之受到影響,如圖7所示.

2.2.7 超聲波功率對黃酮提取率的影響 總黃酮提取率隨著超聲波功率的升高而增加,超聲波功率為240 W處達到最高,隨后逐漸降低.超聲波功率的增大,有利于黃酮的溶出,但能量過高,也會導致黃酮分解,如圖8所示.

2.3 正交試驗及結果在單因素實驗結果的基礎上,其他因素為最佳的條件下,主要考查乙醇體積分數、料液比、酶用量、酶解時間對提取率影響進行正交試驗設計.取3個水平按L9（34）進行正交實驗,以黃酮提取率為評價標準,確定最佳工藝.實驗結果見表1,方差分析見表2.

表1 L9（34）正交實驗設計及結果Table 1 L9（34） orthogonal experimental design and results

由表1和表2可知:乙醇體積分數、料液比、酶解時間、酶用量等因素均對荔枝殼中總黃酮的提取有影響；由極差R可知,各因素對黃酮提取率的影響主次順序為:A＞C＞B＞D；從荔枝殼中提取黃酮的工藝條件最優組合為A2B3C3D2,即乙醇體積分數50%,料液比1∶70,提取時間為100 min,酶用量為0.12%為最佳提取條件.方差分析知:乙醇體積分數及酶解時間對黃酮提取率有影響具有顯著性,料液比及酶用量對黃酮提取率有影響但不具顯著性.為進一步驗證正交試驗的結果及重現性,在最優條件下進行4次平行實驗,荔枝殼的黃酮提取率分別為:5.145%、5.177%、5.016%、5.048%,平均提取率為5.10%.

表2 正交試驗的方差分析Table 2 The variance analysis of the orthogonal experiment

2.4 抗氧化性試驗結果

2.4.1 清除·OH活性 實驗結果為:提取物在2.9～29 μ g/mL范圍內,對·OH 清除率為 19.89% ～66.67%,如圖9所示.

2.4.2 清除O2-·活性 實驗結果為:提取物在29～116 μ g/mL 范圍內,對 O2-·清除率為13.41%～50.227%,如圖10所示.

3 結論

本文采用單因素聯合正交試驗設計,建立以超聲波協同酶法提取了荔枝殼中的總黃酮方法,并對提取產物實驗了清除·OH和O2-·活性測定,得出提取荔枝殼中黃酮的最佳工藝條件為:乙醇體積分數50%,料液比1∶70,提取時間為100 min,酶用量為0.12%,荔枝殼中黃酮類物質的提取率為5.10%.提取產物對O2-·和·OH自由基具有較強的清除能力.

本法作為一種天然產物活性成分分離提取的新技術,具有條件溫和、快速的特點.將超聲波和纖維素酶的特點綜合利用,對提取荔枝殼中的黃酮具有一定的適用價值.荔枝殼中黃酮物質的分離純化等問題有待進一步探究.

致謝內江師范學院自然科學基金（12NJZ02）對本文給予了資助,謹致謝意.

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