三聚氰胺分子印跡聚合物的合成與識別機理研究

方盧秋, 歐文林

（長江師范學院 化學化工學院,重慶 涪陵408100）

1 預備知識

近年來,發生在國內嬰幼兒奶粉受三聚氰胺污染導致嬰幼兒腎結石事件以及在美國發生多起飼料致死寵物事件,使三聚氰胺成為國內外公眾關注的熱點［1-2］.三聚氰胺（Melamine,簡寫為 Mel,化學式為C3H6N6）,學名三氨三嗪,俗稱蜜胺、蛋白精,是一種三嗪類含氮雜環的有機化合物；主要用于制造三聚氰胺甲醛樹脂,普遍存在于塑料、涂料等材料中.微溶于水,可溶于甲醇、甲醛、熱乙二醇、甘油、吡啶等,不溶于丙酮、醚類［3］.因食品和飼料工業蛋白質含量測定大多采用總氮測定的方法,而三聚氰胺含氮量高達66%左右［4］,常被非法添加到食品和飼料中以提高蛋白質的含量指標,給消費者健康帶來危害.

目前,國內外檢測食品及飼料中三聚氰胺殘留,通常采用液相色譜法［5］、氣相色譜 -質譜法［6］、液相色譜 -質譜法［7］、毛細管電泳技術等［8］,這些方法成本較高,在檢測前都需要進行復雜的樣品預處理,如對樣品進行液-液萃取后,采用多步柱凈化和富集.

分子印跡技術是近幾十年來發展起來的一種包含多種學科的研究方法.分子印跡聚合物（MIP）對目標分子具有高度的選擇性,且性能穩定、價格低廉,可以解決樣品前處理復雜、成本較高等問題,至今已被用于傳感器、色譜分離、固相萃取和人工抗體等領域［9-10］.為了選擇性地富集分離與特異性地分子識別三聚氰胺,人們研究合成了幾種三聚氰胺分子印跡聚合物［11-13］.

本研究以三聚氰胺為模板分子,優化選擇了溶劑；以丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、鄰氨基酚、甲基丙烯酸甲酯為功能單體進行選擇實驗；以二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯劑,以偶氮二異丁腈為引發劑,分別進行本體聚合法和沉淀聚合法制備MIP和NIP（不含模板分子的空白分子印跡聚合物）,選擇較優的制備方法；并對三聚氰胺分子印跡聚合物的分子識別機理進行實驗研究.

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器丙烯酸（簡寫為AA,成都市科龍化工試劑廠）；a-甲基丙烯酸（簡寫為MAA,成都市科龍化工試劑廠）；甲基丙烯酸甲酯（簡寫為MMA,成都市科龍化工試劑廠）；丙烯酰胺（簡寫為AM,成都市科龍化工試劑廠）；鄰氨基酚（簡寫為OAP,五聯化工廠）；二甲基丙烯酸乙二醇酯（簡寫為EGDMA,東京化成工業株式會社）；偶氮二異丁腈（簡寫為AIBN,成都市科龍化工試劑廠）；三聚氰胺（成都科龍化工試劑廠）；甲醇（簡寫為Met,色譜純,天津市大茂化學試劑廠）；乙腈（色譜純,天津市光復精細化工研究所）；冰醋酸（成都市科龍化工試劑廠）；高純氮氣；以上化學試劑均為分析純,實驗中所使用的水均為超純水.

AA、MAA、MMA、AM、EGDMA、AIBN 使用前精制方法如下所述.

丙烯酸的精制:移取50 mL AA,加10.0 g活性炭顆粒,振蕩30 min,干過濾后置于4℃冰箱中保存.

α-甲基丙烯酸的精制:移取50 mL MAA,加入10.0 g活性炭顆粒,振蕩30 min后干過濾,置于4℃恒溫箱中保存.

甲基丙烯酸甲酯的精制:在500 mL分液漏斗中加入250 mL甲基丙烯酸甲酯,用質量分數5%NaOH溶液洗滌至無色.用超純水洗滌至中性后,再用無水硫酸鈉干燥一周,減壓蒸餾,餾出液于恒溫箱中4℃密封冷藏.

丙烯酰胺的精制:稱50 g丙烯酰胺溶于40℃的20 mL超純水中,置冰箱冷卻結晶,用布氏漏斗過濾,自然晾干,在20～30℃下真空干燥24 h,保存于恒溫箱中.

二甲基丙烯酸乙二醇酯的精制:取50 mL EGDMA加入質量分數10%NaOH溶液20 mL于分液漏斗中,用NaOH溶液分3次洗滌,再加入無水CaCl230 g,干過濾得精制品.

偶氮二異丁腈的精制:取質量分數95%乙醇50 mL加入磨口錐形瓶中,回流加熱至沸騰,加入5 g偶氮二異丁腈,振蕩至AIBN溶解,抽濾熱溶液,在4℃下冷卻結晶后,在干燥器中干燥,成品保存于棕色試劑瓶中.

超聲波清洗機（SB-5200D型,寧波新芝生物科技股份有限公司）；電子天平（EL104型,梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；調速振蕩器（HY-8型,常州國華電器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-6型,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；紫外可見分光光度計（U-3010型,日本日立公司）；振蕩混合器（S25型,德國IKA公司）；光照培養箱（YSEI型,重慶市永生實驗儀器廠）.

2.2 實驗方法

2.2.1 溶劑的選擇實驗 準確稱取25 mg（為0.198 2 mmol）三聚氰胺于10 mL比色管中,分別加入用于分子印跡聚合物合成的常見溶劑5.0 mL,在調速振蕩器上振蕩2 h.以三聚氰胺的溶解速度相對較快和溶解數量較多為選擇依據,確定所要選定的溶劑.

2.2.2 功能單體的選擇實驗 準確稱取25 mg三聚氰胺于10 mL比色管中,按照三聚氰胺∶功能單體的物質的量比為1∶4的比例加入功能單體,再分別加入選定的溶劑5.0 mL.將混合液超聲振蕩30 min,室溫下靜置24 h后,移取0.1 mL混合液,用相應溶劑稀釋至10 mL,以選定的溶劑為參比,在波長為200～400 nm范圍內進行紫外吸收光譜掃描.

2.2.3 三聚氰胺分子印跡聚合物的制備 三聚氰胺分子印跡聚合物的合成采用本體聚合法與沉淀聚合法,制備對應的MIP和NIP.

1）本體聚合法.稱取25 mg三聚氰胺于25 mL干燥的比色管中,加入10 mL優化選定的溶劑.按照三聚氰胺∶功能單體∶交聯劑為1∶4∶20的物質的量比,加入功能單體和交聯劑.首先加入功能單體后,超聲波振蕩30 min,在光照培養箱中恒溫4℃預聚合24 h,再加入交聯劑EGDMA和50 mg引發劑AIBN,超聲波振蕩15 min,通入純氮除氧5 min,密封后于60℃恒溫水浴下熱聚合12 h.NIP除不加入Mel外,均按上述步驟操作.制備MIP和NIP各平行2次.將制備好的MIP與NIP于索氏提取器中除去未聚合的模板分子、功能單體、交聯劑、引發劑和溶劑,以甲醇∶乙酸（體積比為9∶1）為模板分子洗脫劑,索氏提取8 h,用甲醇反復洗滌分子印跡聚合物以除去殘留的乙酸,于80℃恒溫干燥8 h后待用.

2）沉淀聚合法.稱取25 mg三聚氰胺于100 mL干燥的碘量瓶中,加入10 mL優化選定的溶劑,再加入40 mL乙腈.其它操作同本體聚合法.

3）分子印跡聚合物的產率計算.用電子天平準確稱量制得的分子印跡聚合物,分別按照下式計算分子印跡聚合物MIP與NIP的產率.

2.2.4 三聚氰胺與功能單體的結合實驗 準確稱取25 mg三聚氰胺于10 mL比色管中,按照功能單體∶三聚氰胺的物質的量比分別為0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的比例加入選定的功能單體,再分別加入選定的溶劑5.0 mL.將混合液超聲振蕩30 min,室溫下靜置24 h后,移取0.1 mL混合液,用相應溶劑稀釋至10 mL,以選定的溶劑為參比,在波長為200～400 nm內進行紫外光譜掃描.

3 結果與討論

3.1 溶劑的選擇三聚氰胺屬于三嗪類雜環化合物,呈弱堿性,在常見的有機溶劑中溶解度較小.三聚氰胺難溶于氯仿、丙酮等低極性溶劑,文獻資料表明在甲醇中溶解性能較二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等要好［14］,以甲醇為溶劑可避免溶劑與三聚氰胺間形成的氫鍵,干擾單體與三聚氰胺的結合.以二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、水為溶劑進行溶解性對比實驗,結果發現三聚氰胺在甲醇為溶劑中的溶解度較大,可以達到5.0 g/L,溶解速度較快,能滿足分子印跡過程對模板分子溶解度的要求.實驗選擇甲醇為分子印跡聚合物制備過程中的溶劑和致孔劑.

3.2 功能單體的選擇采用紫外光譜法比較模板分子三聚氰胺與 AA、AM、MAA、OPA、MMA 5種功能單體相互結合的紫外吸光度,數據表明:三聚氰胺與AM有最大的紫外吸光度差值（見表1）.

表1 三聚氰胺與功能單體結合的紫外吸光度Table 1 UV adsorption degree between Mel and different functional monomers

分析Mel與AM相互作用的紫外吸收光譜圖,可以得知:三聚氰胺的最大吸收峰在222 nm處,功能單體的最大紫外吸收波長在230 nm,丙烯酰胺與三聚氰胺的最大紫外吸收波長相接近.丙烯酰胺與三聚氰胺混合后的紫外光譜掃描曲線表明,最大紫外吸收波長在236 nm,紫外吸光度與混合前相比較發生了很大改變.Mel-AM-Met的紫外吸光度遠大于AM-Met與Mel-Met紫外光譜相疊加的紫外吸光度,表明2種溶液混合后的紫外吸光度不是兩者的簡單疊加,而是2種溶液經分子間的自組裝作用形成了新物質分子的紫外光譜.

功能單體與模板分子間,當兩者最大紫外吸光度相差越大,說明功能單體與模板分子的作用越強［15-16］,從表 1 中可以得出,與 AA、MAA、OPA、MMA相比較,丙烯酰胺與三聚氰胺的相互作用更強,用于合成三聚氰胺分子印跡聚合物,理論上分析AM是較為理想的功能單體.所以,實驗選擇AM為合適的功能單體.

3.3 分子印跡聚合物的產率計算以選擇的溶劑和功能單體,交聯劑選擇二甲基丙烯酸乙二醇酯,引發劑選擇偶氮二異丁腈,合成了三聚氰胺分子印跡聚合物,其產率計算見表2.

從表2可以得出,本體聚合法的分子印跡聚合物產率普遍高于沉淀聚合法.沉淀聚合法的MIP與NIP分子印跡聚合物產率的平均值分別為57.48%和58.85%,本體聚合法的MIP與NIP產率平均值分別為91.35%和92.71%.但是本體聚合制得大塊狀分子印跡聚合物,需要經過粉碎、研磨、篩分、反復沉降處理制得一定顆粒直徑的粉末材料,過程繁瑣,得率較低,所以一般采用沉淀聚合法制備分子印跡聚合物.2種聚合法所得到的MIP聚合物產率的平均值都略低于NIP,從分子印跡聚合物合成上分析,可能是聚合物經過索氏提取洗滌時間充分,將MIP中游離的Mel、AM等完全洗脫去除有關.

表2 三聚氰胺分子印跡聚合物的產率計算Table 2 The calculation of productive rate for MIP and NIP of Mel

表3 三聚氰胺與丙烯酰胺的分子結合比例研究數據Table 3 The recognition mechanism data between Mel and AM molecules

表4 三聚氰胺與丙烯酰胺的分子結合比例與結合常數Table 4 The molecular binding ratio and constant between Mel and AM molecules

3.4 三聚氰胺與功能單體的結合模板分子三聚氰胺與功能單體丙烯酰胺的結合機理通過差示紫外光譜進行研究,可以得知三聚氰胺與丙烯酰胺的分子結合比例以及分子間反應的結合常數.由于AM的濃度b0即［AM］,遠大于三聚氰胺的濃度a0,根據文獻［17］,Mel與AM的結合反應公式可推導和整理得如下表達式:△A＝-K△A+K△ξcla0,式中△A為差示吸光度；K表示Mel與AM結合反應的結合常數；△ξcla0為結合物的組成；n為Mel與AM的分子結合比例,取正整數.

用表3中的數據以對 Δ A作圖,得到圖1、圖2和表4.結果發現,當n＝3時,其回歸方程為＝-492 780△A+374 290 R＝0.910 6,可得到＝-K△A+K△ξcla0.式中的擬合斜率k和結合常數K的絕對值都為4.93×105,三聚氰胺與丙烯酰胺主要以氫鍵結合,三聚氰胺與丙烯酰胺的分子結合比例為1∶3.n＝4時,可由圖2求得擬合斜率k和結合常數K的絕對值都為1.0×108,雖然結合常數K值較大,但從分子結構上進行分析,三聚氰胺分子結構中—NH2上N—H鍵的H可與丙烯酰胺中的氨基氮和羰基氧以氫鍵結合,形成3個很穩定的6元環,如圖3所示.

從分子結構上看這種結合方式最為穩定,可推測三聚氰胺和丙烯酰胺之間通過氫鍵形成了1∶3型的結合物.以分子結合比例研究和分子結構分析2種方法均得到三聚氰胺與丙烯酰胺之間分子結合比例都為1∶3的結論,正是三聚氰胺在其分子印跡聚合物中的選擇性分子識別機理.

4 結論

以三聚氰胺為模板分子,實驗選擇甲醇作為溶劑和致孔劑、丙烯酰胺作為功能單體.采用沉淀聚合法和本體聚合法制備了三聚氰胺分子印跡聚合物,本體聚合法制備所得MIP與NIP聚合物產率的平均值高于沉淀聚合法,但沉淀聚合法制備的分子印跡聚合物易分離,無須碾磨過篩,吸附性能較好,因此,選擇沉淀聚合法為較優合成方法.三聚氰胺與丙烯酰胺之間主要以氫鍵形成1∶3型結合物,產生特異性的選擇性分子識別,結合常數K達到4.93×105,表明分子印跡聚合物結構穩定.

［1］黃春麗,黃和,劉文俠,等.三聚氰胺的毒性殘留及檢測方法研究進展［J］.南方水產科學,2011,7（3）:76-80.

［2］王雪.食品中三聚氰胺檢測方法的研究進展［J］.廣州化工,2011,39（22）:25-26,29.

［3］王延吉.化工原料［M］.北京:化學工業出版社,2004:727-728.

［4］ Brown C A,Jeong K S,Poppenga R H,et a1.0utbreaks of renal failure associated with melamine and cyanuric acid in dogs and cats in 2004 and 2007［J］.J Veterinary Diagnostic Investigation,2007,19（5）:525-531.

［5］ Andersen W C,Turnwseed S B,Karbiwnyk C M,et a1.Determination and confirmation of melamine residues in catfish,trout,tilapia,shlinon,end shrimp by liquid chmmatography with tandem mass spectrometry ［J］.J Agric Food Chem,2008,56（12）:4340-4347.

［6］蔣晨陽,范倩,林德清.氣質聯用法測定飼料中的三聚氰胺［J］.飼料工業,2008,29（8）:48-50.

［7］丁濤,徐錦忠,李健忠,等.高效液相色譜-二極管陣列檢測法及高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺［J］.色譜,2008,26（1）:6-9.

［8］ Chen Z J,Yan X M.Simultaneous determination of melamine and 5-Hydroxymetbylfurfural in milk by capillary eleetrophoresis with diode aray detection［J］.J Agric Food Chem,2009,57（19）:8742-8747.

［9］郭秀春,周文輝.分子印跡技術研究進展［J］.化學研究,2012,23（5）:103-110.

［10］賴家平,孫慧,陳芳,等.分子印跡微米微球的合成方法及在固相萃取中的應用研究進展［J］.分析測試學報,2012,31（9）:1161-1169.

［11］肖靜水,梁俊,彭安國,等.三聚氰胺分子印跡聚合物的合成與光譜學特性［J］.南華大學學報:自然科學版,2010,24（6）:94-98.

［12］周文輝,林黎明,郭秀春,等.三聚氰胺分子印跡聚合物的制備及奶制品中三聚氰胺的分離［J］.分析測試學報,2009,28（6）:687-691.

［13］齊娜,陳娜,陳軍,等.三聚氰胺分子印跡聚合物的制備及固相萃取條件優化比較［J］.河南科技學院學報,2011,39（6）:91-95.

［14］王妍,荊濤,包學偉,等.本體聚合法制備2-氯酚分子印跡聚合物及其性能評價［J］.分析科學學報,2008,24（5）:531-534.

［15］程德軍,黃斌,郭明秀,等.沉淀聚合法合成綠原酸分子印跡聚合物的研究［J］.廣州化工,2011,39（13）:46-47.

［16］方盧秋,祝媛.焦性沒食子酸分子印跡聚合物的制備與吸附特征研究［J］.現代化工,2012,32（1）:57-62.

［17］申中蘭,楊俊,朱曉蘭,等.甲胺磷分子印跡聚合物的結合機理及其分子識別特性的光譜學研究［J］.光譜學與光譜分析,2009,29（1）:78-81.