尾狀山羊草α—醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

薄存瑤等

摘 要： 本研究利用一對α-醇溶蛋白基因的特異引物，從小麥近緣植物尾狀山羊草Y46中克隆獲得5個α-醇溶蛋白基因，與NCBI已提交的α-醇溶蛋白序列進(jìn)行多重比對分析發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的α-醇溶蛋白基因與已知的小麥及其近緣植物中的α-醇溶蛋白基因序列具有較高的相似性，其編碼的氨基酸序列存在一定的多態(tài)性；在潛在的致敏性上，在這5個α-醇溶蛋白序列中未發(fā)現(xiàn)任何已知的與乳糜瀉病相關(guān)的抗原表位，這在小麥及其近緣植物中較為罕見；進(jìn)化分析表明，來自C染色體組中的α-醇溶蛋白與來自M和U染色體組的α-醇溶蛋白具有較近的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 尾狀山羊草；α-醇溶蛋白；基因克隆

中圖分類號： S512.1+9+Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號： 1001 - 4942（2014）08 - 0006 - 05

Cloning and Sequence Analysis of α-Gliadin Genes from Aegilops caudata

Bo Cunyao，Du Xuye，Liu Guojuan，Yin Huayan，Wang Hongwei， Li Anfei， Kong Lingrang

（Agronomy College， Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology， Taian 271018， China）

Abstract Five α-gliadin genes were cloned with a pair of specific primers from Aegilops caudata Y46. Their sequences had higher similarity with those of the published α-gliadin genes of wheat and its kindred plants in NCBI， and their encoded amino acid sequences had polymorphism. None of the published epitopes related with celiac disease were discovered in the five α-gliadins， which was rare in wheat and its kindred plants. The evolution analysis declared that the α-gliadins from C genome had a close relationship with those from M and U genomes.

Key words Aegilops caudata； α-gliadins； Gene clone

麥醇溶蛋白和麥谷蛋白是面筋蛋白的兩大主要組分，其含量和組成影響著小麥面團(tuán)黏彈性和烘焙品質(zhì)[1]。在小麥面粉中醇溶蛋白占總蛋白的40%～50%，其構(gòu)成具有高度的復(fù)雜性和異質(zhì)性[2]。依據(jù)酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）遷移率的差別，將醇溶蛋白分為α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白四類，分別占總蛋白含量的5%、30%、30%和15%[3]。麥醇溶蛋白是由第1、6同源群染色體短臂上的 Gli-1（Gli-A1、Gli-B1和Gli-D1）和Gli-2（Gli-A2、Gli-B2和Gli-D2）位點(diǎn)編碼 [4]，在這六個位點(diǎn)上存在廣泛的變異，目前已在 Gli-1 和Gli-2 位點(diǎn)上鑒定出130個等位變異[5]。

α-醇溶蛋白不但與小麥面粉的加工品質(zhì)密切相關(guān)，也是引發(fā)乳糜瀉病的主要活力蛋白[6]。乳糜瀉病（Celiac Disease，簡稱CD）是一種對小麥麩質(zhì)過敏的腸道疾病，又稱為面筋蛋白過敏性腸病。發(fā)病原理為：易感個體攝入麥類（如小麥、大麥、燕麥和黑麥等）的麩質(zhì)蛋白后，由于小腸吸收的不耐受性引起慢性小腸吸收不良綜合征，嚴(yán)重的甚至?xí)?dǎo)致腸粘膜受損。目前已發(fā)現(xiàn)大量能誘發(fā)CD發(fā)生的分布于醇溶蛋白的T細(xì)胞免疫肽，即“毒性肽”，其中有4種具有較高免疫活性，包括Gli-α9、Gli-α2、Gli-α20和Gli-α，免疫肽段分別為PFPQPQLPY、PQPQLPYPQ、PFRPQQPYPQ和QGSFQPSQQ[7]。

本研究從尾狀山羊草Y46中克隆了5個新的α-醇溶蛋白基因，并對其進(jìn)行了序列分析，為進(jìn)一步豐富小麥α-醇溶蛋白基因資源及品質(zhì)改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

尾狀山羊草（種質(zhì)編號Y46）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。pMD18-T克隆載體購于大連寶生物公司；pESAY-E2表達(dá)載體、Hifi Taq 高保真酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；DH5α菌株、基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購于北京天根公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 將尾狀山羊草種子在室溫下萌發(fā)，當(dāng)葉片長到10 cm左右時，利用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，提取方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 基因克隆及序列測定 根據(jù)GenBank公布的α-醇溶蛋白基因序列設(shè)計引物P1：5′-ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG3′、P2：5′-TCAGTTA/GGTACCG/AAAGATGCC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 序列分析 DNA序列分析、氨基酸序列翻譯、進(jìn)化樹構(gòu)建等參考杜旭燁等[8]的方法。

2 結(jié)果與分析

3 討論

較多研究表明醇溶蛋白的變異和分子結(jié)構(gòu)與面粉的加工品質(zhì)密切相關(guān)。本研究獲得的5個α-醇溶蛋白雖然與已知的α-醇溶蛋白序列具有較高的同源性，但仍存在一些差異，如重復(fù)區(qū)長度的不同、多聚谷氨酰胺區(qū)谷氨酰胺殘基含量的不同以及非谷氨酰胺的出現(xiàn)等。多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)是α-醇溶蛋白的典型特征，這兩個區(qū)幾乎全由谷氨酰胺組成。其中，編碼谷氨酰胺的密碼子有兩個：CAG和CAA，它們以不同的串聯(lián)重復(fù)形式出現(xiàn)，形成類似微衛(wèi)星（SSR）的序列。在多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)CAG和CAA兩個密碼子幾乎各占一半，而在多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)只出現(xiàn)CAA密碼子。非谷氨酰胺的殘基一般為A、E、L、R和K五種氨基酸中的一個或幾個。Li等[9]研究表明長的重復(fù)區(qū)與面筋的加工品質(zhì)呈正相關(guān)。另外，Xie等[10]研究表明高的谷氨酰胺殘基含量會提高面筋的粘彈性，可能是由于谷氨酸鹽間的相互作用提高了氫鍵的含量。Anderson等[11]指出，非谷氨酰胺殘基的出現(xiàn)大多是由單個堿基的替換造成的，有時也會發(fā)生兩個堿基的替換，如GCA（丙氨酸）。

α-醇溶蛋白也是誘發(fā)乳糜瀉病的主要活力蛋白[6]。目前關(guān)于α-醇溶蛋白中的毒性多肽報道的比較多，并且大多位于小麥的A和D基因組。據(jù)李玉閣等[12]報道B基因組來源的α-醇溶蛋白的毒性較小，而A、D基因組，尤其是D基因組來源的α-醇溶蛋白對CD患者具有較高的毒性。關(guān)于C基因組來源的α-醇溶蛋白的毒性報道較少，本研究克隆的5個α-醇溶蛋白沒有發(fā)現(xiàn)毒性肽，因此對CD患者來說可能是安全的。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Dachkevich T， Redaelli R， Biancardi A M， et al. Genetics of gliadins code by the group 1 chromosome in high quality bread wheat cultivar Neepawa[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1993， 86： 389-399.

[2] 李敏， 高翔， 陳其皎， 等. 普通小麥中α-醇溶蛋白基因（GQ 891685） 的克隆、表達(dá)及品質(zhì)效應(yīng)鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 43（23）： 4765-4774.

[3] Woychik J H， Boundy J A， Dimler R J. Stareh gel-electrophoresis of wheat gluten proteins with concentrated urea[J]. Arch. Biochem. Biophys.， 1961， 94：477-482.

[4] 朱西平， 李鑫， 李雅軒， 等. 普通小麥及近緣粗山羊草α-醇溶蛋白基因的克隆、定位與進(jìn)化分析[J]. 作物學(xué)報， 2010， 36（4）： 580-589.

[5] 王曙光， 楊海峰， 孫黛珍， 等. 小麥醇溶蛋白亞基與品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析[J]. 中國糧油學(xué)報， 2013， 28（5）：31-35.

[6] Li J， Wang S L， Cao M， et al. Cloning， expression， and evolutionary analysis of α-gliadin genes from Triticum and Aegilops genomes[J]. J. Appl. Genetics， 2013， 54： 157-167.

[7] Ciccippo R， Sabatino A D， Corazza G R.The immune recognition of gluten in coeliac disease[J]. Clinical and Experimental Immunology， 2005， 140（3）：408-416.

[8] 杜旭燁， 周婷婷， 許驥坤， 等. 柱穗山羊草類燕麥儲藏蛋白基因克隆和序列分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 44（11）： 1-4.

[9] Li M， Cao X， Chen Q J， et al. Cloning prokaryotic expression and in vitro function analysis of α-gliadin gene from common wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（23）： 4765- 4774.

[10] Xie Z Z， Wang C Y， Wang K， et al. Molecular characterization of the celiac disease epitope domains in α-gliadin genes in Aegilops tauschii and hexaploid wheat （ Triticum aestivum L.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2010， 121（7）： 1239-1251.

[11] Anderson O D， Greene F C. The α-gliadin gene family. II. DNA and protein sequence variation， subfamily structure， and origins of pseudogenes [J]. Theor. Appl. Genet.， 1997， 95： 59-65.

[12] 李玉閣， 邢冉冉， 崔一飛， 等. 鄭豐5號α-醇溶蛋白的克隆與序列分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報， 2013， 28（4）： 46-52.

[13] 曹亞萍. 小麥的起源、進(jìn)化與中國小麥遺傳資源[J]. 小麥研究， 2008， 29（3）： 1-10.

2 結(jié)果與分析

3 討論

較多研究表明醇溶蛋白的變異和分子結(jié)構(gòu)與面粉的加工品質(zhì)密切相關(guān)。本研究獲得的5個α-醇溶蛋白雖然與已知的α-醇溶蛋白序列具有較高的同源性，但仍存在一些差異，如重復(fù)區(qū)長度的不同、多聚谷氨酰胺區(qū)谷氨酰胺殘基含量的不同以及非谷氨酰胺的出現(xiàn)等。多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)是α-醇溶蛋白的典型特征，這兩個區(qū)幾乎全由谷氨酰胺組成。其中，編碼谷氨酰胺的密碼子有兩個：CAG和CAA，它們以不同的串聯(lián)重復(fù)形式出現(xiàn)，形成類似微衛(wèi)星（SSR）的序列。在多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)CAG和CAA兩個密碼子幾乎各占一半，而在多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)只出現(xiàn)CAA密碼子。非谷氨酰胺的殘基一般為A、E、L、R和K五種氨基酸中的一個或幾個。Li等[9]研究表明長的重復(fù)區(qū)與面筋的加工品質(zhì)呈正相關(guān)。另外，Xie等[10]研究表明高的谷氨酰胺殘基含量會提高面筋的粘彈性，可能是由于谷氨酸鹽間的相互作用提高了氫鍵的含量。Anderson等[11]指出，非谷氨酰胺殘基的出現(xiàn)大多是由單個堿基的替換造成的，有時也會發(fā)生兩個堿基的替換，如GCA（丙氨酸）。

α-醇溶蛋白也是誘發(fā)乳糜瀉病的主要活力蛋白[6]。目前關(guān)于α-醇溶蛋白中的毒性多肽報道的比較多，并且大多位于小麥的A和D基因組。據(jù)李玉閣等[12]報道B基因組來源的α-醇溶蛋白的毒性較小，而A、D基因組，尤其是D基因組來源的α-醇溶蛋白對CD患者具有較高的毒性。關(guān)于C基因組來源的α-醇溶蛋白的毒性報道較少，本研究克隆的5個α-醇溶蛋白沒有發(fā)現(xiàn)毒性肽，因此對CD患者來說可能是安全的。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Dachkevich T， Redaelli R， Biancardi A M， et al. Genetics of gliadins code by the group 1 chromosome in high quality bread wheat cultivar Neepawa[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1993， 86： 389-399.

[2] 李敏， 高翔， 陳其皎， 等. 普通小麥中α-醇溶蛋白基因（GQ 891685） 的克隆、表達(dá)及品質(zhì)效應(yīng)鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 43（23）： 4765-4774.

[3] Woychik J H， Boundy J A， Dimler R J. Stareh gel-electrophoresis of wheat gluten proteins with concentrated urea[J]. Arch. Biochem. Biophys.， 1961， 94：477-482.

[4] 朱西平， 李鑫， 李雅軒， 等. 普通小麥及近緣粗山羊草α-醇溶蛋白基因的克隆、定位與進(jìn)化分析[J]. 作物學(xué)報， 2010， 36（4）： 580-589.

[5] 王曙光， 楊海峰， 孫黛珍， 等. 小麥醇溶蛋白亞基與品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析[J]. 中國糧油學(xué)報， 2013， 28（5）：31-35.

[6] Li J， Wang S L， Cao M， et al. Cloning， expression， and evolutionary analysis of α-gliadin genes from Triticum and Aegilops genomes[J]. J. Appl. Genetics， 2013， 54： 157-167.

[7] Ciccippo R， Sabatino A D， Corazza G R.The immune recognition of gluten in coeliac disease[J]. Clinical and Experimental Immunology， 2005， 140（3）：408-416.

[8] 杜旭燁， 周婷婷， 許驥坤， 等. 柱穗山羊草類燕麥儲藏蛋白基因克隆和序列分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 44（11）： 1-4.

[9] Li M， Cao X， Chen Q J， et al. Cloning prokaryotic expression and in vitro function analysis of α-gliadin gene from common wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（23）： 4765- 4774.

[10] Xie Z Z， Wang C Y， Wang K， et al. Molecular characterization of the celiac disease epitope domains in α-gliadin genes in Aegilops tauschii and hexaploid wheat （ Triticum aestivum L.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2010， 121（7）： 1239-1251.

[11] Anderson O D， Greene F C. The α-gliadin gene family. II. DNA and protein sequence variation， subfamily structure， and origins of pseudogenes [J]. Theor. Appl. Genet.， 1997， 95： 59-65.

[12] 李玉閣， 邢冉冉， 崔一飛， 等. 鄭豐5號α-醇溶蛋白的克隆與序列分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報， 2013， 28（4）： 46-52.

[13] 曹亞萍. 小麥的起源、進(jìn)化與中國小麥遺傳資源[J]. 小麥研究， 2008， 29（3）： 1-10.

2 結(jié)果與分析

3 討論

較多研究表明醇溶蛋白的變異和分子結(jié)構(gòu)與面粉的加工品質(zhì)密切相關(guān)。本研究獲得的5個α-醇溶蛋白雖然與已知的α-醇溶蛋白序列具有較高的同源性，但仍存在一些差異，如重復(fù)區(qū)長度的不同、多聚谷氨酰胺區(qū)谷氨酰胺殘基含量的不同以及非谷氨酰胺的出現(xiàn)等。多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)是α-醇溶蛋白的典型特征，這兩個區(qū)幾乎全由谷氨酰胺組成。其中，編碼谷氨酰胺的密碼子有兩個：CAG和CAA，它們以不同的串聯(lián)重復(fù)形式出現(xiàn)，形成類似微衛(wèi)星（SSR）的序列。在多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)CAG和CAA兩個密碼子幾乎各占一半，而在多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)只出現(xiàn)CAA密碼子。非谷氨酰胺的殘基一般為A、E、L、R和K五種氨基酸中的一個或幾個。Li等[9]研究表明長的重復(fù)區(qū)與面筋的加工品質(zhì)呈正相關(guān)。另外，Xie等[10]研究表明高的谷氨酰胺殘基含量會提高面筋的粘彈性，可能是由于谷氨酸鹽間的相互作用提高了氫鍵的含量。Anderson等[11]指出，非谷氨酰胺殘基的出現(xiàn)大多是由單個堿基的替換造成的，有時也會發(fā)生兩個堿基的替換，如GCA（丙氨酸）。

α-醇溶蛋白也是誘發(fā)乳糜瀉病的主要活力蛋白[6]。目前關(guān)于α-醇溶蛋白中的毒性多肽報道的比較多，并且大多位于小麥的A和D基因組。據(jù)李玉閣等[12]報道B基因組來源的α-醇溶蛋白的毒性較小，而A、D基因組，尤其是D基因組來源的α-醇溶蛋白對CD患者具有較高的毒性。關(guān)于C基因組來源的α-醇溶蛋白的毒性報道較少，本研究克隆的5個α-醇溶蛋白沒有發(fā)現(xiàn)毒性肽，因此對CD患者來說可能是安全的。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Dachkevich T， Redaelli R， Biancardi A M， et al. Genetics of gliadins code by the group 1 chromosome in high quality bread wheat cultivar Neepawa[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1993， 86： 389-399.

[2] 李敏， 高翔， 陳其皎， 等. 普通小麥中α-醇溶蛋白基因（GQ 891685） 的克隆、表達(dá)及品質(zhì)效應(yīng)鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 43（23）： 4765-4774.

[3] Woychik J H， Boundy J A， Dimler R J. Stareh gel-electrophoresis of wheat gluten proteins with concentrated urea[J]. Arch. Biochem. Biophys.， 1961， 94：477-482.

[4] 朱西平， 李鑫， 李雅軒， 等. 普通小麥及近緣粗山羊草α-醇溶蛋白基因的克隆、定位與進(jìn)化分析[J]. 作物學(xué)報， 2010， 36（4）： 580-589.

[5] 王曙光， 楊海峰， 孫黛珍， 等. 小麥醇溶蛋白亞基與品質(zhì)性狀的相關(guān)性分析[J]. 中國糧油學(xué)報， 2013， 28（5）：31-35.

[6] Li J， Wang S L， Cao M， et al. Cloning， expression， and evolutionary analysis of α-gliadin genes from Triticum and Aegilops genomes[J]. J. Appl. Genetics， 2013， 54： 157-167.

[7] Ciccippo R， Sabatino A D， Corazza G R.The immune recognition of gluten in coeliac disease[J]. Clinical and Experimental Immunology， 2005， 140（3）：408-416.

[8] 杜旭燁， 周婷婷， 許驥坤， 等. 柱穗山羊草類燕麥儲藏蛋白基因克隆和序列分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 44（11）： 1-4.

[9] Li M， Cao X， Chen Q J， et al. Cloning prokaryotic expression and in vitro function analysis of α-gliadin gene from common wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2010， 43（23）： 4765- 4774.

[10] Xie Z Z， Wang C Y， Wang K， et al. Molecular characterization of the celiac disease epitope domains in α-gliadin genes in Aegilops tauschii and hexaploid wheat （ Triticum aestivum L.） [J]. Theoretical and Applied Genetics， 2010， 121（7）： 1239-1251.

[11] Anderson O D， Greene F C. The α-gliadin gene family. II. DNA and protein sequence variation， subfamily structure， and origins of pseudogenes [J]. Theor. Appl. Genet.， 1997， 95： 59-65.

[12] 李玉閣， 邢冉冉， 崔一飛， 等. 鄭豐5號α-醇溶蛋白的克隆與序列分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報， 2013， 28（4）： 46-52.

[13] 曹亞萍. 小麥的起源、進(jìn)化與中國小麥遺傳資源[J]. 小麥研究， 2008， 29（3）： 1-10.