神經節苷脂對腦癱大鼠大腦皮質區Nestin、NGF表達的影響

金 玲，何小進，尹玲桃，江興林*

（湖南懷化醫學高等專科學校診斷教研室，湖南 懷化 418000）

神經節苷脂對腦癱大鼠大腦皮質區Nestin、NGF表達的影響

金 玲，何小進，尹玲桃，江興林*

（湖南懷化醫學高等專科學校診斷教研室，湖南 懷化 418000）

目的觀察神經節苷脂（GM1)對腦癱大鼠大腦皮質區神經巢蛋白（Nestin）、神經生長因子（NGF）表達的影響，探討GM1促進腦癱神經修復的可能機制。方法選擇出生10周雄性SD大鼠200只，隨機分為3組：假手術組60只，腦癱模型140只，再分為模型組70只，腹腔注射生理鹽水；GM1組70只，腹腔注射GM1。分別在術后0～24 h的7個時間點利用酶聯免疫法檢測大鼠大腦皮質區Nestin、NGF表達情況，并在實驗前和后1～4 d觀察大鼠的體質量變化情況。 結果 （1）大鼠大腦皮質區 Nestin表達 GM1組 0～24 h、模型組 0～12 h明顯高于假手術組（P<0.01）；GM1組 16～24 h明顯高于模型組 （P<0.01）。（2）GM1組大鼠大腦皮質區NGF表達0～24 h明顯高于模型組 （P＜0.05）和假手術組 （P＜0.01）。模型組 NGF 表達僅 0、4、8 h 高于假手術組（P＜0.05）。（3）GM1組術后第 1、2 天體質量緩慢增加，至第 3、4 天明顯高于模型組（P<0.05），接近假手術組（P＞0.05），模型組體質量增加不明顯。結論預防性使用GM1是通過增強大腦皮質的Nestin和NGF表達并延長表達時間來發揮其對實驗性腦癱大鼠的神經保護作用。

腦性癱瘓；神經節苷脂；神經巢蛋白；神經生長因子；大鼠

腦性癱瘓簡稱腦癱，是一種中樞神經系統損傷引起的非進行性功能障礙[1]。隨著新生兒醫學的進步，新生兒死亡率逐年下降，但腦癱的發病率反而有升高趨勢，世界范圍內大約有1 500萬腦癱患兒，我國發病率為1.8‰～4‰[2]。腦癱的治療至今仍為世界性醫學難題，是神經科學領域的研究熱點之一。雖然現代醫學對腦癱的病因學、病理研究取得了一定進展，但治療上并無大的突破，故尋求新的治療腦癱思路、方法、藥物以提高腦癱患兒的生存質量并減少由此致兒童殘疾是醫學界努力的目標。為了解決這一臨床上的難題，不少科研工作者把目光投到腦損傷修復機制的研究上。本實驗觀察神經節苷脂（GM1)對腦癱大鼠大腦皮質區神經細胞神經巢蛋白（Nestin）、神經生長因子（Nerve growth factor，NGF）表達的影響，初步探討藥物干預對腦損傷大鼠受損神經功能修復的可能機制，為臨床應用藥物治療腦癱提供實驗依據。現將方法和結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取出生10周并經適應性喂養3 d至體質量在200～250 g的健康雄性SD大鼠200只（來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證書號：SCXK（湘）2011-0003）。適應性喂養采用的飼料及屏蔽環境實驗設施由中南大學實驗動物中心（SPF級）提供，在光/暗周期為12 h/12 h(光照時間7：00-9：00）的條件下飼養于籠中，自由獲得飼料和飲水。

1.1.2 藥物 GM1，商品名“申捷”，北京四環制藥有限公司生產，藥品批準文號：H20083224，生產批號：4010531，注射劑，2 mg/mL。

1.1.3 主要儀器和試劑 采用芬蘭352型352017148酶標分析儀，芬蘭AC8型洗板機；NGF酶聯免疫分析試劑盒、Nestin酶聯免疫分析試劑盒，均購自北京永輝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 造模方法按楚勝華等[3]運用特制的造模打擊裝置，以自由落體撞擊建立動物腦癱模型。將200只大鼠隨機分為假手術組60只，GM1組和模型組各70只。大鼠造模前禁食8 h，實驗時將大鼠俯臥位固定于腦立體定向儀上，消毒頭部皮膚，按以10%水合氯醛按0.35 g/kg進行腹腔內注射麻醉，正中切開頭皮后剝離骨膜，充分暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5 mm、中線旁2.5 mm處鉆一直徑5 mm的骨窗，并保持硬膜完整。假手術組：不施加砝碼撞擊即封閉頭皮，未致腦癱；模型組和GM1組：用20 g砝碼于30 cm高處墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，致右頂葉中度腦挫裂傷，最后封閉頭皮。術后蘇醒帶回到原飼養處喂養，并按楚勝華的曠野試驗等［3］行為學測評標準確定腦癱模型的建立。成功后才用于實驗，實驗完成后剩余大鼠一律處死。

1.2.2 給藥方法 假手術組、模型組均按20 mL/（kg·d） 腹腔注射生理鹽水；GM1組給予濃度為2 mg/mL 的 GM1注射液按 20 mL/（kg·d）腹腔注射，以上各組每天1次，術前連續注射3 d。

1.2.3 標本采集 造模后在 0、2、4、8、12、16、24 h時間點，分別在各組中提取6只大鼠，以頸動脈取血后處死大鼠，剪斷頭顱，沿正中線切開頭皮，剝開顱骨，暴露完整的大腦組織，撕開硬腦膜后，用彎鑷取出大腦最外層頂葉皮質放入標記好的冰凍管，置-80℃冰箱保存。所有的標本處理好后，分別稱取各份標本2 g，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）2 mL中，將標本充分研成勻漿，2 000 r/min離心20 min，收集上清液，分裝后冷凍待用。

1.3 檢測指標

1.3.1 Nestin、NGF的檢測 采用芬蘭352型酶標分析儀、芬蘭AC8型洗板機，按NGF酶聯免疫和Nestin酶聯免疫分析試劑盒操作使用說明，進行兩個指標的檢測。即通過包被、加樣、加酶標抗體、加底物液顯色、終止反應，在酶標儀上于450 nm波長處，以空白管調零測定吸光度值。

1.3.2 體質量測定 3組大鼠分別于手術前、術后第1～4天，各隨機取10只，采用動物電子天平測定體質量。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠術后不同時間點大腦皮質區Nestin含量的比較

GM1組0～24 h和模型組 0～12 h大鼠大腦皮質區Nestin含量明顯高于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.01）。GM1組大鼠大腦皮質區的 Nestin 0～12 h含量與模型組比較無顯著差異 （P＞0.05），16～24 h明顯高于模型組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）。結果見表1。

2.2 各組大鼠不同時間點大腦皮質區NGF含量的比較

GM1組大鼠大腦皮質區NGF含量0～24 h均明顯高于模型組（P＜0.05）和假手術組（P＜0.01）；模型組大鼠大腦皮質區NGF含量僅0、4、8 h高于假手術組（P＜0.05）。 結果見表 2。

2.3 各組大鼠不同時間點體質量變化的比較

3組大鼠各隨機取10只，分別于手術前、術后第1天至第4天5個時間點測量體質量。術前3組大鼠平均體質量無顯著性差異（P＞0.05）；術后假手術組體質量逐天增加，至第3、4天明顯高于模型組（P＜0.05）；GM1組第 1、2 天體質量緩慢增加， 至第3、4天明顯高于模型組（P＜0.05），接近假手術組。結果見表3。

3 討論

GM1是一種促進中樞神經系統損傷后修復的藥物，是重要的內源性神經營養因子前體增強劑，可以增強神經營養因子活性，具有促進神經生長、恢復神經功能等作用[4]。Nestin是中樞神經系統一種獨特的中間絲蛋白[5]，出生后表達很快降低并消失，僅在少數保持神經發生功能的部位有表達。Nestin是反映中樞神經系統損傷最早、快速應答的敏感標志物之一[6-7]，如缺血性腦損傷早期Nestin即可在損傷最嚴重的區域表達最明顯，并且可誘導中樞神經系統細胞的原位增殖和神經細胞的再生[8]。NGF也是神經營養因子之一，是神經系統中最重要的生物活性物質之一，NGF具有神經元營養和促突起生長雙重生物學功能，對神經元的損傷修復和功能恢復有重要的調控作用[9]。

表1 各組大鼠術后不同時間點大腦皮質區Nestin含量的比較 （±s，ng/L）

表1 各組大鼠術后不同時間點大腦皮質區Nestin含量的比較 （±s，ng/L）

注：與假手術組比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較△△P＜0.01。下表同。

組 別假手術組模型組GM1組n 6 6 6 0 h 100.1±2.7 143.3±3.3**142.4±2.6**2 h 109.0±2.6 135.4±4.4**142.3±1.2**4 h 107.5±1.2 130.9±2.6**142.1±3.0**8 h 108.1±7.1 144.6±5.0**141.5±4.6**12 h 115.1±3.2 144.6±2.1**139.4±2.8**16 h 117.8±1.1 114.9±9.9 136.7±2.2**△△24 h 116.6±2.0 115.8±7.3 137.8±4.9**△△

表2 各組大鼠術后不同時間點大腦皮質區NGF含量的比較 （±s，ng/L）

表2 各組大鼠術后不同時間點大腦皮質區NGF含量的比較 （±s，ng/L）

組 別假手術組模型組GM1組n 6 6 6 0 h 188.7±33.7 229.6±27.3*401.1±24.3**△△2 h 201.2±50.3 208.4±6.8 362.2±36.2**△△4 h 193.9±44.6 264.9±43.2*327.7±47.0**△△8 h 209.4±18.6 249.1±27.6*292.2±57.9**△△12 h 219.2±25.7 193.7±31.2 287.5±35.1**△△16 h 205.6±8.6 198.4±9.1 295.2±18.1**△△24 h 218.5±55.2 218.5±25.3 294.3±4.5**△△

表3 各組大鼠術前及術后4 d內平均體質量變化比較 （±s，g）

表3 各組大鼠術前及術后4 d內平均體質量變化比較 （±s，g）

注：與假手術組和GM1組同時間點比較*P＜0.05。

組 別假手術組模型組GM1組n 6 6 6術前230.2±20.1 230.4±25.4 220.5±19.9術后第1天240.2±13.3 230.6±18.7 230.4±12.0術后第2天250.0±17.2 230.9±21.0 240.2±12.1術后第3天260.8±19.8 240.1±19.6*260.6±12.1術后第4天270.5±18.5 240.6±20.3*270.1±15.9

在設計本實驗時，我們增加了0 h這個時間點，假手術組是于大鼠封閉頭皮蘇醒后立即測定為0 h；GM1組與模型組是于大鼠封閉頭皮蘇醒后確定腦癱模型建立，再立即進行測定為0 h。其目的是觀察動物手術或腦癱模型建立后是否快速出現Nestin、NGF的應激性表達增加。實驗結果證明確實如此。腦癱大鼠（包括GM1組和模型組）大腦皮質Nestin、NGF表達0 h即顯著高于假手術組。0 h以后，GM1組Nestin、NGF表達明顯高于模型組，這證明了GM1的保護作用。GM1組大鼠大腦皮質區Nestin表達0～24 h高于假手術組，16～24 h高于模型組；NGF表達0～24 h高于假手術組和模型組。實驗中GM1組大鼠體質量增長明顯高于模型組。這提示大鼠造模前保護性用藥GM1可降低腦損傷的程度，增加神經營養因子Nestin、NGF的表達，這與諸葛小寅等[10]的研究結果基本一致。由此看來，預防性使用藥物GM1可以顯著提高實驗性腦癱大鼠大腦皮質Nestin、NGF的表達和延長表達時間，這可能是GM1降低了腦癱損傷，起到保護作用的主要原因。

實驗觀察術后4 d內實驗動物的體質量變化情況。GM1組腦癱模型動物術后第1、2天體質量緩慢增長，至術后第3、4天平均體質量增長明顯高于模型組，接近假手術組。模型組腦癱模型動物體質量增長不明顯，術后第3、4天平均體質量明顯低于GM1組和假手術組。這說明假手術組動物手術麻醉后雖打開顱骨，大腦本身卻未受損傷，動物醒后無腦癱，對平時的飲食影響不大，體質量每天有所增加。GM1組因為預防性的使用了GM1，腦癱模型動物的受損程度得到保護，進食影響較少。模型組腦癱后進食受阻，每天體質量增加不明顯，且因體質衰弱，死亡較多，這與鄭修元等[8]的研究相似，本實驗中各組死亡率比較已有論文發表[11]。由此推測，GM1對實驗性腦癱大鼠可能起到了保護作用。

[1]付 強，祁巖超，唐純志，等.針刺和神經干細胞聯合治療腦癱幼鼠的效果評價[J].湖南中醫藥大學學報，2011，31（6）：51-53.

[2]趙彩嬌，盧海泉，金瑞勤，等.針刺治療小兒腦癱常用穴規律探析[J].湖北中醫雜志，2014，36(3)：56-59.

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[4]費立博，狄佳，聶時南，等.神經生長因子聯合神經節苷脂干預彌漫性軸索損傷患者的臨床觀察 [J].中國急救醫學，2014，34(2)：155-158.

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[7]Suzuki S，Namiki J，Shibata S，et a1．The neural stem／progenitor cellmarkernestin isexpressed in proliferative endothelial cells，but not in mature vasculature[J]．J Histochem Cytochem，2010（58）：721-730．

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[11]金 玲，黃民江，李洪亮，等.神經節苷脂對實驗性顱腦外傷大鼠的保護作用及機制[J].中國康復醫學雜志，2013，12（28）：1 142-1 145.

（本文編輯 徐愛良）

Sdudy Ganglioside on Expression of Nestin and NGF in Cerebral Palsy Cerebral Cortex

JIN Ling,HE Xiaojin,YIN Lingtao,JIANG Xinglin*
（Department of Diagnosis,Huaihua Medical College,Huaihua,Hunan 418000,China）

ObjectiveTo observe the ganglion monoglyceride(GM1)body weight of rats in cerebral palsy and brain cortex Nestin(Nestin),nerve growth factor(NGF)expression,and to explore GM1may promote nerve repair mechanisms of cerebral palsy.Methods10 weeks birth of 200 male SD ratswere randomly divided into three groups:sham group 60-no cerebral palsy,cerebral palsy model 140,divided into model group 70,intraperitoneal injection of saline,the GM1group 70,intraperitoneal injection GM1.Nestin and NGF expressions of cerebral cortex Nestin in rats were detected by immunohistochemistry at 7 time points of the postoperative 0～24 h periods.The total weight of experimental animals was observed during preoperative and postoperative 1～4 days.Results① The GM1group 0～24 h,the model group 0～12 h Nestin expression in ratcerebralcortex wassignificantly higherthan the sham group(P＜0.01);GM1group 16～24h Nestin expression in rat cerebral cortex was significantly higher than the model group(P＜0.01). ② The GM1group 0～24 h NGF expression in rat cerebral cortex was significantly higher than the model group(P＜0.05)and the sham group(P＜0.01).Model rat cerebral cortex expression of NGF only at 0,4,8 h higher than the sham group(P＜0.05).③GM1group after the first 2 days of weight increased slowly,while the weight after 3 or 4 days was significantly higher(P＜0.05),close to the sham group(P＞0.05).Model group,the weight was not significant.ConclusionGM1was used preventability and its neuroprotective effects on experimental rat cerebral cortex of the brain were improved by enhancing Nestin and NGF expression.

cerebral palsy;GM1;Nestin;NGF;Rat

R651.1，R969

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.08.004.013.04

2014-03-03

湖南省科技廳科技計劃項目（2009FJ3200）；湖南省中醫藥管理局科研計劃項目（2012124）。

金 玲，女，碩士，副教授，主要從事心腦血管系統疾病的防治和研究工作。

* 江興林，男，教授，E-mail：jxlin6@163.com。

·中藥分析與制劑·