番石榴葉具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的倍半萜雜二醛分離與鑒定

歐陽文 ，朱曉艾 ，劉潤南 ，劉曉娟 ，粟龍杰 ，謝 磊 ，曹 庸 *（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 4008；.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 5064）

番石榴葉具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的倍半萜雜二醛分離與鑒定

歐陽文1，朱曉艾2，劉潤南1，劉曉娟2，粟龍杰1，謝 磊1，曹 庸2*（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

目的分離純化番石榴葉乙酸乙酯萃取物，并對其抑制α-葡萄糖苷酶活性作用進(jìn)行研究。方法采用硅膠、凝膠柱層析分離純化，波譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，比色法進(jìn)行活性測定。結(jié)果分離得到三種倍半雜萜二醛，分別鑒定為psidials A，psiguadial A和guajadial；活性測試結(jié)果顯示guajadial具有抑制α-葡萄糖苷酶活性，且顯著優(yōu)于阿卡波糖。結(jié)論首次報(bào)導(dǎo)guajadial為番石榴葉具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的成分。

番石榴葉；倍半萜雜二醛；分離鑒定；α-葡萄糖苷酶

隨著世界人口的老齡化以及飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的改變，糖尿病己經(jīng)成為一種常見病、多發(fā)病，由糖尿病并發(fā)癥引起的死亡人數(shù)己列于心腦血管疾病和癌癥之后，成為第三大死亡原因，因此尋找安全、有效的途徑預(yù)防和治療糖尿病的發(fā)生發(fā)展已成為緊迫的國際性任務(wù)[1-2]。番石榴（Psidium guajava Linn.）為桃金娘科番石榴屬果樹，民間的廣泛應(yīng)用和大量的科學(xué)研究結(jié)果證明番石榴葉具有明顯的降糖作用且無毒副作用[3-6]，在日本，F(xiàn)OSHU（特定保健用食品）已有批準(zhǔn)作為防治II型糖尿病的含番石榴葉提取物的番石榴茶上市[7]。Oh等[8]報(bào)道了番石榴葉乙酸乙酯萃取物能夠抑制α-葡萄糖苷酶，同時(shí)可改善高凝血癥；Wang等[9]通過建立抑制α-葡萄糖苷酶模型，證明了番石榴葉乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物為具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的最佳組分。本實(shí)驗(yàn)前期的結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，本文繼續(xù)對番石榴葉乙酸乙酯萃取物進(jìn)行了分離純化研究，獲得了三個(gè)倍半萜雜二醛化合物，同時(shí)通過96孔比色法，以阿卡波糖為陽性對照組，對三個(gè)倍半萜雜二醛單體抑制α-葡萄糖苷酶活性進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

番石榴葉，于2012年9月采自廣東省茂名市林業(yè)局番石榴種植基地，經(jīng)湖南吉首大學(xué)廖博儒教授鑒定為桃金娘科番石榴屬植物Psidium guajavaLinn.，植物標(biāo)本（2012-09-A01）現(xiàn)存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院天然活性物研究中心。

1.2 儀器與試劑

INOVA-500MHz高分辨超導(dǎo)核磁共振譜儀(瑞士Bruker公司)，萬分之一電子天平 (梅特勒-托利多)，Wallac VICTOR31420酶標(biāo)儀 （美國PE公司）。α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）（日本 TCI公司）；阿卡姆糖（Sigma 公司）；薄層層析用硅膠G、H，柱層析用硅膠(100～200目)(青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20(美國GE公司)，其他試劑均為分析純。水為超純水。

2 方法

2.1 提取與分離純化

番石榴葉2 kg，粉碎成粗粉，用12倍體積95%乙醇回流冷浸提取3次，60℃減壓回收溶劑，加適量水分散，乙酸乙酯液充分萃取，減壓回收溶劑得乙酸乙酯浸膏45.9 g。取乙酸乙酯萃取浸膏40 g，經(jīng)硅膠常壓、低壓柱層析，重結(jié)晶及葡萄糖凝膠LH-20(SephadexLH-20)層析，共分離得到了化合物1（132 mg）、化合物 2（22 mg）、化合物 3（42 mg）。

2.2 抑制α葡萄糖苷酶活性測定

[10-11]，略有改動，在96孔板中進(jìn)行比色法測定：首先將20 μL的α-葡萄糖苷酶 (0.8 U/mL)加入到樣品孔中，平行6份，然后將測試樣品溶于DMSO配制成母液，用0.01 mol/L pH 6.8磷酸緩沖液按一定比例稀釋，每孔加入樣品溶液120 μL（測試樣品的最終濃度見表1），37℃條件下預(yù)培養(yǎng)15 min，再加入5 mmol/L反應(yīng)底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷溶液20 μL。37℃水浴反應(yīng)15 min后，每個(gè)樣品孔中加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液80 μL終止反應(yīng)，在405 nm波長處比色測定吸光度。

實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性空白、陰性對照、樣品空白、樣品組；其中陰性對照為溶解樣品溶液按測試樣品的最終濃度同樣用磷酸緩沖液稀釋加入反應(yīng)，陰性空白為緩沖溶液代替酶溶液；樣品空白為相同體積的磷酸緩沖液代替酶溶液。化合物抑制率由樣品OD值對于空白和對照OD值計(jì)算，計(jì)算公式如下：

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

對所獲得的單體化合物，采用薄層層析分析純度，純度合格后測定單體化合物的核磁共振譜，同時(shí)對獲得的波譜數(shù)據(jù)綜合解析，并與文獻(xiàn)比較進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 抑制α-糖苷酶活性測定

通過建立抑制α-葡萄糖苷酶活性測試模型，以阿卡波糖為陽性對照，測定了乙酸乙酯萃取物的抑制活性，結(jié)果表明阿卡波糖在625～156 μg/mL范圍內(nèi)劑量依賴性地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其IC50為（358.2±9.2）μg/mL，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11]接近；乙酸乙酯萃取物在312.5～1 250 μg/mL范圍內(nèi)呈劑量依賴性地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其IC50為（1 129.9±53.7）μg/mL。

繼續(xù)對乙酸乙酯萃取組分進(jìn)行分離純化，獲得了三個(gè)單體化合物，測定其抑制α-葡萄糖苷酶活性，結(jié)果顯示化合物1（psidials A）和化合物2（psiguadial A）在 625～10 μg/mL 濃度范圍內(nèi)無明顯抑制效果， 而化合物 3 （guajadial）在 78.1～19.3 μg/mL濃度內(nèi)呈劑量依賴性地抑制α-糖苷酶活性，其 IC50為（52.3±2.6）μg/mL，顯著優(yōu)于陽性對照阿卡波糖。見表1。

表1番石榴葉乙酸乙酯萃取物和guajadial抑制 α-葡萄糖苷酶活性測定 （±s，n=6）

表1番石榴葉乙酸乙酯萃取物和guajadial抑制 α-葡萄糖苷酶活性測定 （±s，n=6）

注：與乙酸乙酯萃取物比較#P<0.05；與阿卡波糖比較*P<0.05。

阿卡波糖625 57.9–5.62 312.5 44.6–3.98 156.2 28.8–3.74乙酸乙酷萃取物1250 51.2–2.69 625 29.3–3.421129.9–53.7 312.5 8.02–1.78化合物3(guajadial) 19.3 17.0–3.93 78.1 73.3–3.89 39.1 42.4–4.08

3.2 單體結(jié)構(gòu)鑒定

3.2.1 化合物1 無色方狀結(jié)晶，香草醛-濃硫酸顯紫紅色，1H-NMR （CDCl3，500 MHz）：δ13.46，13.11，10.12，10.17(1H，each s)，7.1-7.3(5H，m)，5.05(1H，d，J=12.0 Hz)，4.20 (1H，d，J=6.0 Hz)，0.98，1.01，1.19(3H，each s)；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：δ59.3(C-1)，23.9(C-2)，47.8(C-3)，88.0(C-4)，35.0(C-5)，24.4(C-6)，35.5(C-7)，150.8(C-8)，42.2(C-9)，36.1(C-10)，34.7(C-11)，29.7(C-12)，21.7(C-13)，22.2(C-14)，111.2(C-15)，35.0(C-1’)，107.5(C-2’)，168.5(C-3’)，104.2(C-4’)，167.5(C-5’)，104.7(C-6’)，164.1(C-7’)，138.6(C-8’)，129.9(C-9’)，128.0(C-10’)，126.9(C-11’)，128.0(C-12’)，129.9(C-13’)，192.0(C-14’)，191.6(C-15’)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[12]報(bào)道的psidials A一致。

3.2.2 化合物2 無色針狀結(jié)晶，香草醛-濃硫酸顯紫紅色，1H-NMR （CDCl3，500 MHz）：δ13.78，13.56，10.40，10.14(1H，each s)，7.1-7.3(5H，m)，4.5(1H，s)，1.14(3H，s)，1.12(3H，d，J=6.5 Hz)，0.93(3H，s)，0.59(1H，m)，0.31 (1H，dd，J=8.5，12.0 Hz)，0.25(3H，s)；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：δ104.1(C-1)，36.6(C-2)，37.9(C-3)，47.8(C-4)，48.7(C-5)，26.3(C-6)，23.9(C-7)，20.3(C-8)，30.3(C-9)，39.9(C-10)，19.2(C-11)，28.4(C-12)，14.3(C-13)，17.4(C-14)，24.9(C-15)，53.2(C-1’)，114.2(C-2’)，166.7(C-3’)，108.2(C-4’)，168.2(C-5’)，105.6(C-6’)，170.5(C-7’)，140.9(C-8’)，130.3(C-9’)，127.6(C-10’)，126.4(C-11’)，127.6(C-12’)，130.3(C-13’)，193.7(C-14’)，191.8(C-15’)。 以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[13]報(bào)道的psiguadial A一致。

3.2.3 化合物3 無色針狀結(jié)晶，香草醛-濃硫酸顯紫紅色，1H-NMR （CDCl3，500 MHz）：δ13.46，13.08，10.12，10.08(1H，each s)，7.1-7.3(5H，m)，4.56(1H，s)，4.06(1H，s)，3.40(1H，d，J=10.0 Hz)，1.28(3H，s)，1.03(3H，s)，1.00(3H，s)；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）：δ53.2(C-1)，22.2(C-2)，37.1(C-3)，84.3(C-4)，43.4(C-5)，30.4(C-6)，35.4(C-7)，150.7(C-8)，41.3(C-9)，36.7(C-10)，33.8(C-11)，30.3(C-12)，22.0(C-13)，21.2(C-14)，110.2(C-15)，43.4(C-1’)，105.5(C-2’)，163.4(C-3’)，104.1(C-4’)，168.3(C-5’)，104.7(C-6’)，169.5(C-7’)，143.7(C-8’)，128.7(C-9’)，127.9(C-10’)，126.2(C-11’)，127.9(C-12’)，128.7(C-13’)，192.1(C-14’)，191.5(C-15’)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[14]報(bào)道的 guajadial一致。

以上三種化合物結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 番石榴葉乙酸乙酯萃取物三種倍半雜萜二醛結(jié)構(gòu)式

4 討論

從具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的乙酸乙酯萃取物中分得的三種倍半雜二醛，經(jīng)CA文獻(xiàn)檢索，該類罕見新穎骨架唯獨(dú)存在于番石榴葉中。

通過單體化合物的抑制α-葡萄糖苷酶活性測定，表明化合物3（guajadial）的抑制活性顯著優(yōu)于陽性對照物阿卡波糖，推測其為番石榴葉降糖活性成分之一。

化合物 1（psidials A）和化合物 3（guajadial）為同分異構(gòu)體，兩者的差異僅僅在1’位苯基取代的空間構(gòu)效上的差異，其中化合物1的C-1’苯基為α構(gòu)構(gòu)型，無抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，而化合物3的C-1’苯基為β構(gòu)型，有顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，結(jié)合文獻(xiàn)[15]表明苯基的存在與否對于降糖活性起關(guān)鍵性作用，同時(shí)其空間構(gòu)型也是影響活性的重要因素。

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（本文編輯 楊 瑛）

Sesquiterpenoids with α-Glucosidase Inhibitory Activities from the Leaves of Psidium guajava Linn.

OU Yangwen1,ZHU Xiaoai2,LIU Runnan1,LIU Xiaojuan2,SU Longjie1,XIE Lei1,CAO Yong2*
(1.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208;2.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong 510642,China)

ObjectiveTo study the α-glucosidase inhibitory active compounds from the ethyl acetate extract of guava leaves.MethodsThe compounds were separated from the ethyl acetate extract by repeating silica gel and Sephadex LH-20 column chromatography.The1H-NMR,13C-NMR techniques were used to identify the chemicalstructures.The α-glucosidaseinhibitory activities were tested by colorimetry.ResultsThree special meroterpenoids were isolated and identified as psidials A,psiguadial A and guajadial.Guajadial showed α-glucosidase inhibitory activities significantly and its activity was better than that of Acarbose.Conclusions Guajadial as one of the α-glucosidase inhibitory active compound from Guava leaves was reported for the first time.

leavesofPsidium guajava Linn.;Meroterpenoids;isolation and structural identification;α-Glucosidase

* 曹 庸，男，教授，E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.08.005.017.04

2014－05－17

國家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（31201321）；湖南省教育廳項(xiàng)目（13B084）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013J4100075）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)本科教學(xué)質(zhì)量工程項(xiàng)目（TD-007）。

歐陽文，男，博士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。