環介導等溫擴增法快速檢測手足口病病原體

何書等

【摘要】 目的：建立逆轉錄（RT）-環介導等溫擴增方法（LAMP），以快速檢測手足口病最重要的兩種病原體：腸道病毒71型（EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CA16）。方法：收集手足口病患兒咽拭子標本93份，針對EV71和CA16病毒的VP1基因特異性序列8個區域各設計6條LAMP引物，分別于63 ℃（EV71）、65 ℃（CA16A）擴增1 h，日光下觀察結果，與實時熒光定量PCR比較檢測特異性和敏感性。結果：EV71、CA16的LAMP最低檢測限均為500拷貝/管，與對照病毒無交叉反應。93份標本中，RT-PCR方法檢測顯示EV71陽性44例，CA16陽性36例；RT-LAMP方法檢測顯示EV71陽性46例，CA16陽性36例，兩種方法間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：應用RT-LAMP檢測手足口病病原體EV71、CA16快速、靈敏、經濟、特異性高，適合在基層醫療機構推廣應用。

【關鍵詞】 逆轉錄-環介導等溫擴增技術； 腸道病毒71型； 柯薩奇病毒A組16型； 手足口病

【Abstract】 Objective：To rapidly detect pathogens of hand-foot-and-mouth disease （HFMD） by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP），the two most important pathogens：enterovirus 71 （EV71） and coxsackievirus group A type 16 （CA16）.Method：A total of 93 swab specimens were collected from HFMD children.Six primers which recognized 8 distinct regions on the VP1 gene of enterovirus 71 （EV71） and coxsackievirus A16 （CA16） were designed for RT-LAMP assay.The target genes were amplified for 1 hour at isothermal temperatures of 63 ℃ for EV71 and 65 ℃ for CA16，respectively.The sensitivity and specificity of RT-LAMP were compared with fluorescence quantitative PCR using chi-square test measures.Result：The lower limits of EV71 and CA16 detection were both 500 copies/tube by RT-LAMP assay.No cross reaction was shown among other viruses.Of all the 93 swab specimens，46 cases were EV71 positive and 36 cases were CA16 positive by RT-LAMP，while 44 cases were EV71 positive and 36 cases were CA16 positive by quantitative PCR.There were no significant differences between the two measures（P>0.05）.Conclusion：RT-LAMP may be a more rapid，sensitive，specific and economical measure for detection of HFMD pathogens，especially in primary health service.

【Key words】 Loop-mediated isothermal amplification； Enterovirus 71； Coxsackievirus A16； Hand-foot-and-mouth disease

First-authors address：Huaihe Hospital of Henan University，Kaifeng 475003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.024

手足口病（hand-foot-and-mouth disease，HFMD）是以發熱、口腔潰瘍和皰疹為特征的一種常見的兒童傳染病，可導致心肌炎、無菌性腦脊髓膜炎和腦炎等嚴重并發癥[1-2]。據統計，2011年全國手足口病的患病總人數達1 619 706人，死亡509人[3]。腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus A16，CA16）是HFMD最重要的兩種病原體，尤其是EV71與HFMD的暴發流行密切相關，可引起較嚴重的中樞神經系統病變，病死率高[4-5]。因此，建立快速、準確、特異的EV71和CA16病毒檢測方法十分重要[6]。

目前，RT-PCR（real-time polymerase chain reaction）技術已成為臨床快速診斷腸道病毒的重要手段，其特點為敏感性高，檢測迅速，擴增產物無需電泳，可直接定量，檢測系統密閉，不易發生污染，但需要昂貴的RT-PCR儀，試劑的價格也較高，故較難在基層推廣應用。逆轉錄（reverse transcription，RT）-環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi在2000年開發的一種核酸擴增技術[7]。即建立針對靶基因8個特定區域的6條特異性引物，在恒溫條件下（60～65 ℃），利用鏈置換DNA聚合酶在幾十分鐘內快速、高效、特異地完成對靶DNA序列的擴增，目前此技術已廣泛用于臨床微生物檢測[8-10]。本研究采用RT-LAMP技術檢測HFMD病原體EV71和CA16，評價其特異性和敏感性，探討在基層醫療單位中推廣應用的前景。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 收集2012年1-10月本院臨床診斷為手足口病的患兒咽拭子標本93份。用采樣棉簽拭抹扁桃體和口腔咽后壁，然后將采樣棉簽在標本保存液中充分攪動，將病毒洗下，4 ℃，8000 rpm，5 min。將咽拭液于-80 ℃凍存，用于RT-LAMP和熒光定量PCR檢測。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒為天根生物公司生產，AMV反轉錄酶和RT-PCR試劑盒TAKARA公司生產，Bst DNA聚合酶為NEB公司生產，Betaine為Sigma公司生產，羥基萘酚藍（HNB）為晶純試劑有限公司產品，CA16、EV71、諾如病毒和輪狀病毒陽性核酸購自河南省疾病控制中心，CA16、EV71 RT-PCR檢測試劑盒購自達安公司。

1.3 核酸提取 采用天根生物公司生產的核酸提取試劑盒，按照說明書對臨床樣本進行核酸抽提。

1.4 熒光定量PCR檢測 將模板逆轉錄后，按照操作說明書操作：94 ℃預變性5 min；93 ℃變性15 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個循環；72 ℃延伸10 min。

1.5 建立RT-LAMP

1.5.1 引物設計 EV71和CA16均以VP1基因作為引物設計的靶基因。在序列的保守區域，利用PE4軟件設計引物。引物由上海生工公司合成。

1.5.2 反應體系建立與優化 設置不同的dNTPs濃度、內外引物濃度比（1：1、1：2、1：4、1：8、1：10）、Mg2+濃度（2 mM、2.8 mM、3.6 mM、4.4 mM、5.2 mM）、Betaine不同的反應時間（30 min、40 min、50 min、60 min、

70 min）和不同反應溫度（60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃），獲得EV71和CA16病毒的最佳反應體系為：15 U/L AMV逆轉錄酶1.5μL，8 U/μL BstDNA聚合酶1 μL，10×反應緩沖液2.5 μL，0.3 mM/L HNB，0.4 M dNTPs，0.8 μM FIP和BIP，0.2 μM F3和B3，2.8 M MgSO4，1 M Betaine，5 μL模板RNA，加DEPC水至25 μL。充分混勻后，置于水浴鍋內1 h，EV71病毒、CA16病毒分別63 ℃、65 ℃。80 ℃，2 min后終止反應。

1.5.3 擴增產物的檢測

1.5.3.1 肉眼檢測 根據日光下反應液顏色變化判斷結果：淺藍色為陰性，深藍色為陽性。

1.5.3.2 電泳檢測 將擴增產物點樣于2%瓊脂糖凝膠中，電泳約1 h，成像，陽性電泳結果顯示為梯狀條帶；陰性電泳結果無任何條帶。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，兩種檢測方法采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-LAMP法檢測EV71、CA16病毒的特異性 對臨床樣本的RNA分別進行EV71和CA16病毒的RT-LAMP檢測。EV71檢測結果的見圖1，電泳泳道中的樣品從左到右依次是DNA marker、EV71、空白對照、CA16、輪狀病毒、諾如病毒。只有EV71呈現LAMP典型的梯狀條帶，而其余泳道均無梯狀條帶，因此本研究的RT-LAMP方法對檢測EV71方法具有高度特異性。

3 討論

HFMD是我國兒童高發傳染病之一，如果能夠在基層醫療單位確診病情，就可以在第一時間有效地控制疫情的暴發與蔓延。熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性高的優點，是目前臨床檢測EV71、CA16等病原體的首選方法，但由于受到要求昂貴的設備儀器等限制，不宜在普通醫療單位中應用[11]。

RT-LAMP方法是利用有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶和兩對特殊引物，可以在不改變溫度的條件下使引物與模板結合，并進行鏈置換擴增反應。本研究建立了EV71和CA16病毒的RT-LAMP檢測技術，只需在63 ℃或65 ℃的恒溫條件下反應60 min，檢測迅速，耗時短。

RT-LAMP法可擴增出109～1010倍靶序列拷貝，靈敏度相當、甚至高于定量熒光PCR方法[12]。LAMP反應的結果判斷須利用不同染料，常見的染料有SYBR Green和羥基萘酚藍（hydroxy naphthol blue，HNB）等，其中HNB在反應前即可加入，不干擾反應[13]。本研究的LAMP技術選擇HNB作為顏色指示劑，其靈敏度與熒光定量PCR相同，達到500拷貝/管[14]，兩種方法的EV71、CA16檢測結果亦無顯著差異。

對于細菌類病原體的檢測，LAMP技術可直接取患病部位的體液進行病原檢測；反應結束后無需電泳，只需觀察顏色變化來判斷檢測結果；整個反應在一個管中進行，操作簡單方便。LAMP所需試劑在常溫下比較穩定[15]。LAMP反應不需要昂貴的PCR儀和試劑，只需一個簡單的恒溫器，因此具有在基層醫療單位推廣應用的價值。

本研究建立了HFMD病原體EV71和CA16的單管RT-LAMP檢測技術，該方法快速、敏感、特異、經濟，適合在基層醫療機構推廣應用。

參考文獻

[1]黃漢先，溫素琴.手足口病死亡病例的流行病學特點和臨床特點分析[J].中國醫學創新，2013，10（2）：128-129.

[2]周文亮，邢秀偉.216例重癥手足口病高危特征的臨床分析[J].中國醫學創新，2013，10（6）：119-120.

[3]孫唯，祝小平，曹慧.我國手足口病防治研究現狀[J].寄生蟲病與感染性疾病，2012，10（3）：175-177.

[4]喬夢凱，石利民，王燕，等.南京市2011年手足口病流行病學及病原學特征分析[J].中國醫學創新，2013，10（1）：89-91.

[5] Li L，He Y，Yang H，et al.Genetic characteristics of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen，Peoples Republic of China[J].J Clin Microbiol，2005，43（8）：3835-3839.

[6]金玉娟，甘莉萍，陳應堅，等.腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型實驗室檢測研究進展[J].職業與健康，2009，25（17）：1878-1879.

[7] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

[8]黃火清，郁昂.環介導等溫擴增技術的研究進展[J].生物技術，2012，22（3）：90-93.

[9] Kim H J，Kim Y J，Yong D E，et al.Loop-mediated isothermal amplification of vanA gene enables a rapid and naked-eye detection of vancomycin-resistant enterococci infection[J].J Microbiol Methods，2014，5（104）：61-66.

[10] Nzelu C O，Gomez E A，Cáceres A G，et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid mass-screening of sand flies for Leishmania infection[J].Acta Trop，2014，132（12）：1-6.

[11] Yu N，Guo M，He S J，et al.Evaluation of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 specific immunoglobulin M antibodies for diagnosis of hand-foot-and-mouth disease[J].Virol J，2012，9（12）：1254-1260.

[12] Jiang T，Liu J，Deng Y Q，et al.Development of RT-LAMP and real-time RT-PCR assays for the rapid detection of the new duck Tembusu-like BYD virus[J].Arch Virol，2012，157（12）：2273-2280.

[13] Goto M，Honda E，Ogura A，et al.Colorimetric detection of loop-mediated isotheral amplification reaction by using hydroxy naphthol blue[J].Biotechniques，2009，46（6）：167-172.

[14] Mong H O，Tom S，Yuwa P，et al.Evaluation of different clinical sample types in diagnosis of human enterovirus 71-associated hand-foot-and-mouth disease[J].J Clin Microbiol，2007，45（6）：1858-1866.

[15] Thekisoe O M，Bazie R S，Coronel-Servian A M，et al.Stability of loop-mediated isothermal amplification （LAMP） reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates[J].J Vet Med Sci，2009，71（4）：471-475.

（收稿日期：2014-03-09） （本文編輯：歐麗）