響應面分析法優化殼聚糖復合海綿的制備工藝

劉傳榮，陳思浩，鄭玉林，陳玉雙，楊秋杰，周超，朱同賀，樓建中

（1上海工程技術大學化學化工學院，上海 201620；2上海新亞藥業有限公司技術中心，上海 201203；3北卡羅蘭納農工州立大學化工與機械工程學院，NC 27411，USA）

在科學實驗的條件優化中，線性回歸分析可以利用實驗數據得出因素與指標（即響應值）之間的回歸方程，但要求數據量較大，耗時耗資，且只討論一種因素的影響，無法考慮幾種因素的綜合作用；正交試驗設計可同時考慮幾種因素，并尋找最佳因素水平組合，但它不能在給出的整個區域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數表達式即回歸方程，從而無法找到整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值。因此，一種試驗次數少、周期短、求得的回歸方程精度高、能充分反映多種因素間交互作用的多元優化方法——響應面分析法[1-2]成為本文采用的方法。響應面分析法在多個科學領域多有使用，能夠通過回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，同時還可以直觀地表達出各因素間的交叉作用。

近年來，海綿在藥學和醫學領域受到了廣泛的關注，主要研究方向是作為傷口敷料[3]、組織工程支架材料等。海綿醫用敷料[4-8]是醫用敷料的一種，是一類彈性、多孔的固體材料。它不僅具有傳統醫用敷料[9]保護傷口的作用，還具有各種不同的物理、化學性能以及良好的生物性能。例如海綿醫用敷料具有較好的吸水性、保濕性、耐酸耐堿性、滅菌性和生物相容性等特性，可以減少感染和促進傷口愈合，且能較好地吸收滲出液和藥液，不會造成二次傷害，可減輕患者疼痛。

海綿劑系由親水性膠體溶液經發泡、固化、凍干、滅菌而制成的一種海綿狀固體制劑，常用作創面或外科手術輔助止血劑[10-12]。海綿的制備方法及研究進展在文獻資料中已有大量報道，本研究將響應面分析[13-14]法首次應用于復合海綿材料的制備工藝中，以期對復合海綿的開發利用提供理論指導。本實驗選擇殼聚糖、海藻酸鈉、透明質酸鈉3種輔料制備海綿多孔材料，可同時利用三者的優點，避免三者在敷料方面使用的不足，既可保證殼聚糖的可降解性、滅菌性和較好的機械強度，又可以利用海藻酸鈉較好的吸水性和透明質酸鈉的生物相容性。殼聚糖分子鏈上具有伯氨基，海藻酸鈉和透明質酸鈉的分子鏈上都具有羧基，殼聚糖是通過靜電作用與海藻酸鈉和透明質酸鈉結合形成的聚電解質復合物[15]。殼聚糖加入透明質酸鈉材料內，既可避免由透明質酸鈉的溶解性較好，導致的存留時間短，也可以使殼聚糖顯示出更強的抗水解作用[16]。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖（CS，脫乙酰度 80.0～95.0）、海藻酸鈉（SA，化學純）、乙酸（冰乙酸），國藥集團化學試劑有限公司；透明質酸鈉（SH），阿拉丁試劑（上海）有限公司。

真空冷凍干燥箱，德國 CHRiST；電子剝離試驗機（BLD-200N）、傅里葉轉變紅外分光光度計（Nicolet AVATAR 370型），美國Thermo Fisher公司；掃描電子顯微鏡（JSM-5600LV），日本 JEOL公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9123A），上海精宏實驗設備有限公司；電動攪拌機（RW20 DS25），德國 IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖復合海綿制備工藝流程

工藝流程見圖1。

圖1 殼聚糖復合海綿制備工藝流程

1.2.2 海綿復合材料的拉伸強度測試

根據GB/T2792—1998所述，根據試驗要求，用相應寬度的取樣刀制取試樣，選擇試驗所需的試驗速度150 mm/min使用BLD-200N電子剝離試驗機進行拉伸強度測試。

2 結果與討論

2.1 復合海綿材料制備過程中的單因素影響

在進行響應面分析之前，應先通過單因素實驗來選擇實驗因素與水平[17-18]。在本實驗中影響海綿拉伸強度的因素很多，如殼聚糖[19]與海藻酸鈉[20]的配比、透明質酸鈉[21]的濃度、電機攪拌速度、冷凍干燥的時間等。本實驗采用冷凍干燥法，將海綿材料冷凍干燥至恒重，避免了由于含水量不同對拉伸強度的影響。

2.1.1 殼聚糖與海藻酸鈉的配料比

本實驗中控制透明質酸鈉的濃度和電機攪拌速度不變，測定不同殼聚糖與海藻酸鈉的物料配比條件下制得的海綿樣品的拉伸強度，結果如圖2所示。

由圖2所示，在透明質酸鈉濃度與電機攪拌速度一定的情況下，殼聚糖與海藻酸鈉的配比為4∶1時，復合海綿材料的拉伸強度最大，因此可將殼聚糖與海藻酸鈉的配比范圍從4∶1左右延伸，即可確定此因素的“水平”。如表1，該因素的三水平取值為 3∶1、4∶1、5∶1。

圖2 殼聚糖與海藻酸鈉的配料比對拉伸強度的影響

2.1.2 透明質酸鈉的質量分數

本實驗中控制殼聚糖與海藻酸鈉的物料配比為4∶1和電機攪拌速度不變，測定不同透明質酸鈉質量分數的條件下制得的海綿樣品的拉伸強度，結果如圖3所示。

如圖3所示，透明質酸鈉的質量分數在15%時拉伸強度最大，因此可將透明質酸鈉的質量分數從15%向左右延伸，即可確定此因素的“水平”。如表1，該因素的三水平取值為10%、15%、20%。

2.1.3 電機攪拌速度對拉伸強度的影響

本實驗中控制殼聚糖與海藻酸鈉的物料配比為4∶1和透明質酸鈉的質量分數為15%不變，測定不同電機攪拌速度條件下制得的海綿樣品的拉伸強度，結果如圖4所示。

如圖4所示，電機攪拌速度為500 r/min時，海綿材料的拉伸強度最大，此后在700～900 r/min過程中拉伸強度有增大趨勢，這是由于隨著電機攪拌速度增加剪切力增大海綿的結構更加密集。但是與此同時海綿孔結構孔徑更加小，不利于后續應用，故此時500 r/min為最佳攪拌速度。因此可將攪拌速度 500 r/min向左右延伸，即可確定此因素的“水平”。如表1，該因素的三水平取值為400 r/min、500 r/min、600 r/min。

圖3 透明質酸鈉的含量對拉伸強度的影響

圖4 電機攪拌速度對拉伸強度的影響

2.2 采用響應面分析法優化海綿制備工藝

2.2.1 響應面分析因素水平的選取

根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，綜合2.1節中單因素實驗結果，選取殼聚糖與海藻酸鈉配比、透明質酸鈉含量、電機攪拌速度對作為復合海綿材料的拉伸強度的影響顯著的3個因素，在單因素實驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法[22-23]，試驗因素與水平設計見表1。

2.2.2 響應面分析方案及結果

以殼聚糖與海藻酸鈉的物料比A、透明質酸鈉濃度B、轉速C為自變量，以符合海綿材料的拉伸強度為響應值（Y），進行響應面分析試驗。試驗方案及結果見表2。

2.2.3 多元二次響應面回歸模型的建立與分析

對表2試驗結果通過Design-Expert軟件程序進行二次回歸響應面分析，建立多元二次響應面模型：

各因素的方差分析見表3。

模型的F值145.55意味著回歸模型顯著（P＜0.05）。失擬值0.0620表明失擬項（Lack of Fit）不顯著，模型的擬合性較好。從表 3中可以看出，A（電機攪拌速度）、B（透明質酸鈉的含量）、C（殼聚糖與海藻酸鈉的配比）、AB、AC、A2、B2、C2是顯著的模型項（P＜0.05）；而BC的Prob＞F值大于0.1000，表明模型項不顯著（BC）。

表1 響應面分析因素及水平

表2 響應面分析方案及實驗結果

表3 二次響應面回歸模型方差分析

電機攪拌速度和透明質酸鈉含量的影響較大，殼聚糖與海藻酸鈉的配比影響較小，其中電機攪拌速度和透明質酸鈉含量已達到極著顯著水平。

由以上分析得出，本試驗中AB的交互作用和AC的交互作用影響顯著，試驗結果見圖5、圖6，BC的交互作用見圖7。

由圖5可以看出，當透明質酸鈉含量處在某一固定水平時，轉速對制劑拉伸強度的影響均出現了由低到高再由高到低的趨勢，即在試驗范圍內，轉速對拉伸強度的影響出現了最優點。同樣，當轉速一定時，透明質酸鈉的含量對拉伸強度的影響也出現了最優點。兩者對轉速的影響都比較明顯，由此可以看出，在轉速及透明質酸鈉含量的交互作用中，兩個因素對拉伸強度的影響都很大。

由圖6可以看出，當m(CS)/m(SA)比處在某一固定水平時，轉速對制劑拉伸強度的影響出現了最高點，是一個由低到高再由高到低的過程，即在試驗范圍內，轉速對拉伸強度的影響出現了最優點。但在轉速一定時，m(CS)/m(SA)配比對拉伸強度的影響相比之下并不明顯。綜合來看，在轉速及m(CS)/m(SA)配比的交互作用中，轉速對拉伸強度的影響大于 m(CS)/m(SA)配比的影響，是主效應因子。

由圖7可以看出，當CS/SA配比處在某一固定水平時，透明質酸鈉含量對制劑拉伸強度的影響比較明顯，均有最高點的出現。而在透明質酸鈉含量一定時，CS/SA配比對拉伸強度的影響并不明顯，近似成一條直線。綜合來看，在透明質酸鈉含量及CS/SA配比的交互作用中，透明質酸鈉對拉伸強度的影響大于CS/SA配比的影響，是主效應因子。

2.2.4 最優方案及其表征

由 Expert-Design軟件得到的最佳選擇和通過實驗的比較結果如表4。

（1）紅外光譜分析（FTIR） Nicolet AVATAR 370型 FTIR紅外分光光度計分別對 CS、SH、SA及殼聚糖復合海綿進行官能團測試，掃描次數為32次，分辨率為2 cm?1。如圖8所示。

從圖8和表5可以看出，在3250～3600 cm?1處為—OH鍵吸收峰，在2800～3000 cm?1處為 CH3和CH2的C—H伸縮振動峰，在1500～1700 cm?1處為 C=O 伸縮振動峰，在 1400 cm?1處左右為C—H 的彎曲振動峰；在1150 cm?1處左右為C—N伸縮振動峰；在1000～1100 cm?1處為C—O伸縮振動峰。此外，海藻酸鈉 在1607 cm?1處的C=O伸縮振動峰吸收峰在殼聚糖復合海綿中向低頻位移到1550 cm?1，向低波數方向偏移了57 cm?1，說明發生了靜電作用形成了復合物。透明質酸鈉在 1630 cm?1處的C=O伸縮振動峰吸收峰在殼聚糖復合海綿中向低頻位移到1550 cm?1，向低波數方向偏移了80 cm?1，說明發生了靜電作用形成了復合物。

圖5 攪拌速度A與透明質酸鈉含量B的交叉影響的響應面及等高線圖

圖6 攪拌速度A和殼聚糖與海藻酸鈉的物料比C的交叉影響的響應面及等高線圖

圖7 透明質酸鈉含量B及殼聚糖與海藻酸鈉物料比C的交叉影響的響應面及等高線圖

圖8 紅外吸收光譜圖

表4 最佳方案表

（2）掃描電鏡分析（SEM） 將制備好的殼聚糖復合海綿進行噴金處理，在掃描電鏡下進行觀察記錄。

圖9 SEM電鏡掃描圖

表5 吸收峰及其范圍

通過電鏡放大分析后，可以看到殼聚糖-海藻酸鈉-透明質酸鈉海綿表面擁有致密層，且具備均勻的多孔與多層次的結構，孔徑適中，是結構良好的海綿狀材料，并且照片中有明顯的交聯現象。

（3）吸水性能測試 對采用最優方案制備的海綿進行吸水性能測試，海綿自重m1為0.0938 g，海綿充分吸收水后的質量m2為5.6592 g，由此，吸水率Q=( m2? m1)/m1×100%為 5933.3%。

（4）保水性能測試 對采用最優方案制備的海綿進行吸水性能測試，海綿自重m1為0.1058 g，海綿充分吸收水后又經充分離心后的質量 m2'為2.6726 g，由此，保水率 Q'=( m2'? m1)/m1為 2426.1%。

3 結 論

（1）本實驗應用響應面設計法直觀分析了電機攪拌速度、透明質酸鈉含量及殼聚糖海藻酸鈉配比幾個因素對復合海綿狀拉伸強度的影響及各因素的交互影響。

（2）響應面分析表明電機攪拌速度和透明質酸鈉含量對復合海綿狀的拉伸強度影響較大，已達到極著顯著水平。殼聚糖與海藻酸鈉的配比相比之下影響較小。

（3）優化出的最佳工藝條件：電機攪拌速度為541 r/min，透明質酸鈉質量分數為14%，殼聚糖與海藻酸鈉的配比為 3.71∶1，得到理論拉伸強度為0.1652 MPa，實際拉伸強度為0.1709 MPa。

（4）實驗結果顯示，該海綿材料具有均勻的多孔與多層次的結構，吸水、保水性能均良好。

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