丹皮總黃酮的提取及抗氧化活性研究

丁彩真，于曙光，王艷麗，金玉波，鄭國生

（1.青島農業大學化學與藥學院，山東 青島266109；2.即墨市第二中學，山東 即墨266214；3.青島農業大學生命科學學院，山東 青島266109）

丹皮，又名牡丹皮，為毛茛科植物牡丹的干燥根皮，具有清熱涼血、活血散瘀的功效，用于治療血滯經閉、痛經、癰腫瘡毒、跌撲傷痛、溫毒發斑等癥[1］。現代藥理學研究表明，丹皮具有保護心血管系統、抗菌、消炎等作用[2］。丹皮中含有牡丹酚（paeonol）、牡丹酚甙（paeonoside）、牡丹酚原甙（paeonolide）、牡丹酚新甙（apiopaeonoside）、芍藥甙（paeoniflorin）、氧化芍藥甙（oxypaeoniflorin）、苯甲酰芍藥甙（benzoyl－paeoniflorin）、苯甲酰氧化芍藥甙（benzoyl－oxypaeoniflorin）、沒食子酸（gallic acid）、揮發油、植物甾醇、蔗糖、黃酮類化合物等[3－4］。近年來，人們對丹皮的研究主要集中于丹皮酚及其衍生物的生物活性[5－7］，而對丹皮中含有的生物類黃酮研究較少。研究表明，生物體內的黃酮類化合物具有較強的生物活性[8－11］，如抗氧化、抗腫瘤、抗HIV等，同時對心腦血管疾病具有明顯的改善作用。丹皮中生物類黃酮的研究和開發也日益得到人們的重視[12］。

作者以丹皮為原料提取丹皮總黃酮并測定其含量，以常用的抗氧化劑 2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（BHT）和叔丁基對苯二酚（TBHQ）為對照，采用4種方法評價丹皮總黃酮的抗氧化活性，以期從丹皮中提取得到高效抗氧化的生物類黃酮，為資源豐富的牡丹在醫藥、食品等領域的綜合開發利用開辟新的途徑。

1 實驗

1.1 材料與試劑

2013年10～11月份采挖青島農業大學牡丹種植基地3～5年生鳳丹的壯碩根部，剝取根皮，曬干。

石油醚、乙醇、乙醚、丙酮、硫酸、苯酚、硫酸鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（TBA）、鄰苯三酚、鹽酸、H2O2、FeSO4、BHT、二苯代苦味肼基自由基（·DPPH）、蘆丁、TBHQ，均為分析純。

1.2 丹皮總黃酮的提取與含量測定

參照劉昌平[13］提取金銀花中總黃酮的方法：取一定量丹皮，以乙醚為抽提劑，用索氏提取法脫脂并除去脂溶性色素；揮干乙醚，用75%乙醇回流提取得到丹皮總黃酮粗提物；濃縮，干燥，得到粉末即丹皮總黃酮樣品。

以30%乙醇為溶劑配制系列蘆丁標準品溶液，繪制標準曲線，得到擬合回歸方程為c＝0.0105A－0.0116，R2＝0.9989。然后以丹皮總黃酮樣品20.0 mg取代蘆丁，測定丹皮總黃酮樣液的吸光度。按回歸方程計算樣品中丹皮總黃酮含量，并計算其在丹皮中的含量。

1.3 丹皮總黃酮抗氧化活性評價

分別測試不同濃度的丹皮總黃酮樣液對·DPPH、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基的清除率以及對小鼠肝組織脂質過氧化的抑制率，以相同濃度的抗氧化劑（BHT和TBHQ）為對照，綜合評價丹皮總黃酮的體外抗氧化活性。

1.3.1 對·OH清除率的測定

采用Fenton反應（亞鐵離子催化過氧化氫產生·OH）[14－15］，在λ＝536nm處測定反應混合物的吸光度（用蒸餾水調零），按式（1）計算丹皮總黃酮對·OH清除率（D1）：

式中：AP為1.0mL蒸餾水的空白吸光度；As為1.0mL的丹皮總黃酮樣液的吸光度；Ab為用1.0mL 30%乙醇代替1.0mL過氧化氫時測得的吸光度。

參照范秀萍等[16］的方法，在λ＝299nm處測定反應混合物的吸光度（用蒸餾水調零），按式（2）計算丹皮總黃酮對·O－2清除率（D2）：

式中：A0為0.1mL蒸餾水的空白吸光度；A1為0.1mL丹皮總黃酮樣液的吸光度。

1.3.3 對·DPPH清除率的測定

參照彭長連等[17］的方法，在λ＝517nm處測定吸光度，按式（3）計算丹皮總黃酮對·DPPH清除率（D3）：

式中：A0為2.0mL乙醇的空白吸光度；A1為2.0mL丹皮總黃酮試液的吸光度（需要用2.0mL乙醇與2.0mL樣液混勻后調零，以排除樣液本身顏色的影響）。

1.3.4 對小鼠肝組織脂質過氧化抑制率的測定

參照鄭晶泉[18］的方法（TBA 法），在λ＝532nm處測其吸光度，按式（4）計算丹皮總黃酮對脂質過氧化抑制率（D4）：

式中：A0為0.2mL蒸餾水的空白吸光度；A1為0.2mL丹皮總黃酮樣液的吸光度（需要用蒸餾水代替TBA混勻后調零）。

1.3.5 半抑制濃度（IC50）的測定

參照徐清萍等[19］的方法計算各抗氧化測試反應的半抑制濃度（IC50）。

2 結果與討論

2.1 丹皮總黃酮的含量分析

丹皮總黃酮樣品中總黃酮含量為56.72%，在丹皮中的含量為1.6304%。

2.2 丹皮總黃酮的抗氧化活性

2.2.1 丹皮總黃酮對自由基的清除率及對脂質過氧化的抑制率

不同濃度的丹皮總黃酮以及BHT和TBHQ對自由基·OH、、·DPPH的清除率以及對脂質過氧化的抑制率見表1 。

表1 不同濃度下，丹皮總黃酮、BHT和TBHQ對自由基的清除率及對脂質過氧化的抑制率Tab.1 The scavenging rate of radicals and inhibition rate of lipid peroxidation of the total flavonoids fromTree peony bark，BHT and TBHQ at different concentrations

比較相同濃度的丹皮總黃酮、BHT和TBHQ對不同自由基清除率及對脂質過氧化抑制率發現，三者均符合對·OH清除率＞對·DPPH清除率＞對·O－2清除率＞對小鼠肝組織脂質過氧化抑制率的規律。說明3種抗氧化物質可能具有類似的抗氧化機制，推測它們可能具有類似的結構。

比較相同濃度的丹皮總黃酮、BHT和TBHQ對相同自由基清除率及脂質過氧化抑制率發現，基本上符合TBHQ≥丹皮總黃酮＞BHT的規律。BHT是目前國內外廣泛使用的油溶性抗氧化劑，TBHQ是在美國、日本已廣泛使用的效果較好的抗氧化劑，丹皮總黃酮的抗氧化活性略低于或等于TBHQ的抗氧化活性，且遠遠大于BHT的抗氧化活性，在較低濃度下即具有較好的氧化反應抑制作用。

2.2.2 半抑制濃度

在同一體系中，半抑制濃度IC50越小，表明樣品清除自由基的能力越強。丹皮總黃酮、BHT和TBHQ對不同氧化反應的半抑制濃度如表2 所示。

表2 丹皮總黃酮、BHT和TBHQ對4種氧化反應的半抑制濃度Tab.2 The IC50value of the total flavonoids fromTree pe ony bark，BHT and TBHQ to four oxidation reactions

從表2 可看出，同種物質對于不同氧化反應的抑制效果、以及不同物質對于同種氧化反應的抑制效果的規律與2.2.1相同。

3 結論

以常用的化學抗氧化劑BHT和TBHQ為對照，測試了丹皮總黃酮對·OH、、·DPPH的清除能力以及對小鼠肝組織脂質過氧化的抑制作用，并以此來評價丹皮總黃酮的體外抗氧化能力。結果表明，丹皮總黃酮對·OH清除率＞對·DPPH清除率＞對清除率＞對小鼠肝組織脂質過氧化抑制率；丹皮總黃酮具有較強的抗氧化能力；其抗氧化活性略低于或等于TBHQ的抗氧化活性，且遠遠大于BHT的抗氧化活性，在較低濃度下即對多種氧化反應具有抑制作用。表明，丹皮總黃酮是一種很有發展前景的天然抗氧化劑。

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