富硒酵母對(duì)小鼠IL-2水平、空斑形成細(xì)胞溶血能力及腸道菌群的影響

秦順義， 黃寶霞， 秦建華， 王宏祥， 王 昕， 張建斌， 崔 君

（1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津西青 300384；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001）

硒是人和動(dòng)物所必需的微量元素，具有多種重要的生物學(xué)功能，缺硒可導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能、繁殖性能和免疫功能降低 （Weeks等，2012；Chen，2012），因此補(bǔ)硒已成為畜牧業(yè)生產(chǎn)中的常規(guī)措施。由于亞硒酸鈉等無(wú)機(jī)硒源吸收率較低，毒性較高，且易對(duì)環(huán)境造成污染，故其應(yīng)用受到諸多限制。富硒酵母因具有硒含量高、成本低、生物利用率高、毒性小、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，已成為最有可能替代亞硒酸鈉的有機(jī)硒源（Alimohamady等，2013；王宏祥等，2013）。本試驗(yàn)研究富硒酵母對(duì)小鼠血漿白細(xì)胞介素2（IL-2）水平、空斑形成細(xì)胞溶血能力及腸道菌群的影響，以期為富硒酵母的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及主要儀器 富硒酵母：由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院畜禽營(yíng)養(yǎng)代謝病研究室研制，硒含量為500 mg/kg，其中有機(jī)硒含量在90%以上。小牛血清 （中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所）；綿羊紅細(xì)胞（SRBC）和經(jīng)綿羊紅細(xì)胞吸收過(guò)的豚鼠血清補(bǔ)體 （江蘇省農(nóng)科院）；IL-2測(cè)定試劑盒 （解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所）。FMJ-182放射免疫γ-計(jì)數(shù)器 （上海原子核研究所）；721型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；亞硒酸鈉（SS，分析純，天津市化學(xué)試劑研究所）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 昆明系清潔級(jí)小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g，經(jīng)3 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)平均分為3組（雌雄各半）：對(duì)照組、亞硒酸鈉組和富硒酵母組。對(duì)照組每日灌胃0.5 mL蒸餾水，亞硒酸鈉組和富硒酵母組每日分別灌胃亞硒酸鈉（2 μg Se/mL）和富硒酵母（2 μg Se/mL）各 0.5 mL。小鼠自由采食（普通配合飼料）、飲水，飼養(yǎng)過(guò)程中，每天換水，隔日換墊料。整個(gè)試驗(yàn)期為28 d。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法 于試驗(yàn)第11天，每組隨機(jī)選擇8只小鼠（雌雄各半），每鼠腹腔注射SRBC 0.2 mL進(jìn)行致敏。

1.3.1 血漿中IL-2含量的測(cè)定 于試驗(yàn)第15天，從致敏小鼠眼眶取血，分離血漿。血漿IL-2含量用放射免疫法在FMJ-182放射免疫γ-計(jì)數(shù)器上測(cè)定。IL-2放射免疫試劑盒由解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所提供，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.2 脾臟空斑形成細(xì)胞溶血能力測(cè)定 于試驗(yàn)第15天，取致敏小鼠脾臟制成勻漿，用pH 7.4的磷酸緩沖液（PBS）洗滌兩次，制成細(xì)胞懸液（5×106個(gè)/mL），按徐叔云等（2002）的分光光度法測(cè)定空斑形成細(xì)胞溶血能力：取細(xì)胞懸液0.5 mL，加入0.2%的SRBC和10%經(jīng)SRBC吸收過(guò)的豚鼠血清補(bǔ)體各0.5 mL，混勻；另設(shè)不加補(bǔ)體的作為空白；置于37℃的水浴鍋中，保溫1 h，3000 r/min離心5 min，取上清于413 nm處空白調(diào)零測(cè)吸光值。

1.3.3 腸道菌群的分析 試驗(yàn)結(jié)束后，分別用SP、EMB、EC、BLB 和 LBS培養(yǎng)基培養(yǎng)葡萄球菌、大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌及乳桿菌。以無(wú)菌方法取小鼠盲結(jié)腸內(nèi)容物0.1～0.2 g，置已稱(chēng)重的帶玻珠的滅菌小管中，再次稱(chēng)重，計(jì)算出小鼠腸內(nèi)容物重量。按 1∶10（W/V）加入適量稀釋液（滅菌的0.05%酵母粉生理鹽水溶液），然后將小管置于振蕩器上充分振蕩10 min，使其均質(zhì)化后，再依次進(jìn)行10倍系列稀釋至10-9，然后取100 μL加入到各種培養(yǎng)基上，涂布均勻，每種培養(yǎng)基每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板。接種完畢，分別將其進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，37℃，24 h（需氧培養(yǎng)）或 72 h（厭氧培養(yǎng)）后觀察結(jié)果。根據(jù)菌落特點(diǎn)、染色鏡檢，計(jì)算各平板上的菌落數(shù)，并計(jì)算出每克糞便中該菌的數(shù)量，結(jié)果以每克腸道內(nèi)容物中的菌落數(shù)的對(duì)數(shù)表示（lg cfu/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)均以 “平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，如方差分析有顯著性差異，再進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 富硒酵母對(duì)小鼠血漿中IL-2含量和空斑形成細(xì)胞溶血能力的影響 由表1可知，富硒酵母組、亞硒酸鈉組小鼠血漿IL-2含量和空班形成細(xì)胞溶血能力的OD413較對(duì)照組分別提高18.24%（P＜ 0.01）、17.65%（P ＜ 0.05）和 12.82%（P ＜ 0.01）、7.69%（P＜0.05）；富硒酵母組小鼠血漿IL-2含量和空班形成細(xì)胞溶血能力的OD413較亞硒酸鈉組分別提高0.50%和4.76%（P＞0.05）。

表1 富硒酵母對(duì)小鼠空斑形成細(xì)胞溶血能力和血漿IL-2含量的影響（n=8）

2.2 富硒酵母對(duì)小鼠腸道菌群的影響 從表2可知，富硒酵母組、亞硒酸鈉組和對(duì)照組小鼠腸道中葡萄球菌、腸球菌、腸桿菌、乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 富硒酵母對(duì)小鼠腸道菌群的影響lg cfu/g

3 討論

3.1 富硒酵母對(duì)小鼠空斑形成細(xì)胞溶血能力的影響 空斑形成細(xì)胞溶血能力是衡量機(jī)體體液免疫功能的重要指標(biāo)?？瞻咝纬杉?xì)胞溶血能力越強(qiáng)，說(shuō)明機(jī)體的體液免疫功能越強(qiáng)。杜瑩等（2006）研究結(jié)果也表明富硒蛋白能夠促進(jìn)小鼠溶血空斑的形成。葉洪平和陳超（2010）也證實(shí)富硒綠茶可明顯促進(jìn)小鼠溶血空斑的形成。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在外來(lái)抗原綿羊紅細(xì)胞作用下，富硒酵母和亞硒酸鈉均可顯著提高小鼠脾空斑形成細(xì)胞溶血能力，但二者作用效果無(wú)顯著差異。這說(shuō)明補(bǔ)硒可有效增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能。

3.2 富硒酵母對(duì)小鼠血漿中IL-2水平的影響抗原活化的T淋巴細(xì)胞分泌的IL-2細(xì)胞因子，不僅是T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)和活化因子，而且可促進(jìn)B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖和分化。在本試驗(yàn)中，富硒酵母組和亞硒酸鈉組小鼠血漿IL-2均顯著高于對(duì)照組，且富硒酵母組和亞硒酸鈉組小鼠血漿IL-2含量無(wú)顯著差異。由此表明，富硒酵母可促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-2，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能，但其作用效果與亞硒酸鈉相比無(wú)顯著差異。這與秦順義等（2007）和高建忠等（2006）在羔羊和仔豬上的研究結(jié)果相一致。杜立芹等（2000）研究也證實(shí)，富硒酵母可使環(huán)磷酰胺造成的免疫低下小鼠血清IL-2水平顯著增高。在體外試驗(yàn)中，He等（2004）和 Brown 等（1985）也報(bào)道了類(lèi)似的研究結(jié)果。

3.3 富硒酵母對(duì)小鼠腸道菌群的影響 動(dòng)物體內(nèi)腸道菌群主要包括專(zhuān)性厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌。在正常狀態(tài)下，腸道菌群的組成、種類(lèi)都是較為穩(wěn)定的，腸道菌群之間的平衡狀態(tài)在維持動(dòng)物機(jī)體的正常功能以及抵抗外襲菌方面起著重要的作用（O'Hara和 Shanahan，2007）。 本試驗(yàn)結(jié)果表明，富硒酵母對(duì)小鼠腸道中的葡萄球菌、腸球菌、腸桿菌、乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量無(wú)顯著影響，說(shuō)明富硒酵母不能改變小鼠腸道菌群的構(gòu)成和數(shù)量。 陳生龍（2009）和 Mathew等（1998）的研究表明，活酵母或酵母培養(yǎng)物對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的構(gòu)成無(wú)影響。周淑芹和孫文志（2004）研究結(jié)果表明酵母培養(yǎng)物可顯著減少肉仔雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量并可增加雙歧桿菌的數(shù)量。胡友軍等（2003）研究結(jié)果也證實(shí)活性酵母可顯著減少早期斷奶仔豬腸道菌群中大腸桿菌的數(shù)量，并可調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡。以上研究結(jié)果的差異可能與酵母菌的種類(lèi)以及試驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)有關(guān)。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，富硒酵母可顯著提高小鼠血漿IL-2水平和空斑形成細(xì)胞溶血能力，而對(duì)小鼠腸道菌群無(wú)顯著影響。

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