β—紫羅蘭酮與β—乳球蛋白相互作用的光譜法研究

馬保亮 魏良淑 劉桂玲 盧禮萍

摘要：在pH=7.0，t=37℃條件下，采用熒光光譜和紫外可見-吸收光譜研究了β-紫羅蘭酮與β-乳球蛋白的相互作用。研究的結果表明：這種相互作用使β-乳球蛋白發生內源熒光猝滅，其機制為靜態猝滅。通過計算得到了兩者的結合常數（k=0.605×103L/mol）和結合位點數（n=1）。

關鍵詞： β-紫羅蘭酮;β-乳球蛋白;熒光猝滅; 同步熒光譜; 紫外可見-吸收光譜;

引言

β-紫羅蘭酮（β-ionone） 是一種芳香族化合物，結構（如圖2）中含有一個芳香苯環，具有疏水性。它廣泛存在于天然食物中，比如水果、蔬菜、谷物及牛奶中，在醫藥工業中還可以用于合成維生素A和β-胡蘿卜素[4，5]，這與人們的生活息息相關。β-紫羅蘭酮是一個單體，卻表現出較強的抗癌作用[6，7]。研究蛋白質與β-紫羅蘭酮的相互作用，可以為了解β-紫羅蘭酮的生物活性機制提供重要線索。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

F-4600型熒光分光光度計（日本日立公司）;UV-1800型紫外可見分光光度計（上海Shimadzu公司）;UB-10標準型PH計（上海華耀貿易公司 ）;FA1604B型電子分析天平（北京賽多利斯有限公司）;

β-乳球蛋白和β-紫羅蘭酮購買于美國Sigma公司;磷酸鈉緩沖液所用試劑為國內生化公司購置的分析純;所用水為超純去離子水。

1.2 實驗方法

準確稱量β-紫羅蘭酮并配置成濃度為1mmol/L的溶液，準確稱量β-乳球蛋白并配置成5 mg/ml的溶液，其中使用的緩沖液均為磷酸鈉緩沖液（pH=7.0），置于4 的冰箱中保存。

在10 ml比色管中依次加入pH=7.0的緩沖溶液、1.0mlβ-乳球蛋白溶液和一定量的β-紫羅蘭酮溶液，然后在27 和37 水浴鍋中充分培養30分鐘后開始測試熒光光譜。

熒光光譜測量，激發光狹縫和發射光狹縫均為2.5nm。內源發射熒光是以280nm作為激發光波長，記錄300nm-400nm范圍的發射光譜;同步熒光是固定激發波長與發射波長的間距 分別為15nm和60nm， 記錄240-320nmm范圍的熒光光譜。紫外可見-吸收光譜測量范圍為200nm到340nm 。

2 實驗結果與分析

2.1 β-紫羅蘭酮對β-乳球蛋白的猝滅反應

β-LG蛋白分子中含有色氨酸和酪氨酸等氨基酸，具有較強的內源熒光。固定β-LG溶液濃度為0.05mg/ml，在其中加入不同濃度的β-紫羅蘭酮，結果發現，β-LG的熒光峰隨著β-紫羅蘭酮濃度的增加而規律性降低，同時β-乳球蛋白的最大發射峰位發生5nm左右的紅移，如圖3所示，表明β-LG蛋白分子的構象發生了一定的改變。

對于靜態猝滅，結合常數和結合位點數可由結合常數表達式（2）推導求出[10 ]：

（2）

2.4β-乳球蛋白與β-紫羅蘭酮之間的能量轉移效率和結合距離

根據F?rster 非輻射能量轉移理論[11]，可以求出小分子與蛋白質發光基團之間的距離。

能量轉移效率E與供體-受體之間距離r及能量轉移距離臨界R0的關系為：

（6）

R0為能量轉移效率為50%時對應的距離。

（7）

其中 為取向因子，可取受能體與供能體各向隨機分布的平均值 ; 為介質的折射指數，一般取水和有機物折射指數的平均值1.336， 為供能體的光量子產率，通常取蛋白質色氨酸量子產率為0.118，J為供能體的熒光發射譜與受能體的吸收光譜的重疊積分，可表示為：

（8）

其中 為供能體在波長 處的熒光強度， 為受能體在波長 處的摩爾吸光系數。摩爾能量轉移效率可以由下式決定：

（9）

式中F0為能量受體不存在時能量供體的熒光發射強度， F為能量供體和受體濃度為1：1時蛋白質的熒光強度 。

圖5為供能體與受能體濃度為1：1時，供能體β-乳球蛋白的熒光發射光譜（a）與受能體β-紫羅蘭酮的吸收光譜（b）的光譜重疊。將圖中光譜重疊部分分割成極小的矩形面積求和，應用公式（8）算得重疊積分為

代入方程（7）得到臨界距離為 。由式（9）計算得到能量轉移效率為 。根據公式（6）可以算出β-紫羅蘭酮與β-乳球蛋白熒光殘基間的距離為 。該距離小于7nm，符合能量轉移理論。

2.6 β-紫羅蘭酮對β-乳球蛋白構象的影響

β-紫羅蘭酮加入β-乳球蛋白溶液中，兩者發生了結合猝滅反應的同時發射峰位紅移，我們可將通過同步熒光和紫外可見-吸收光譜進一步研究β-紫羅蘭酮對β-乳球蛋白構象的影響。

3 結論

以β-乳球蛋白為基體，通過熒光光譜和紫外可見-吸收光譜研究了β-紫羅蘭酮與蛋白質的結合反應。β-紫羅蘭酮進入蛋白質分子的疏水腔與疏水氨基酸通過氫鍵和范德華力發生作用，這與β-紫羅蘭酮分子的疏水性有關。因為兩者的結合作用，一方面，蛋白質發射熒光強度被猝滅，測算結果表明藥物和發生作用的氨基酸之間作用距離較大，但仍滿足非輻射能量轉移的條件，這也導致了明顯的熒光猝滅;另外，同步熒光光譜中色氨酸熒光發射峰位紅移，體現了藥物與蛋白質的結合位點靠近處于疏水區的色氨酸殘基，并引起了色氨酸所在環境疏水性的變化。紫外可見-吸收光譜中190nm附近較強的吸收峰也發生了顯著紅移，這也進一步證明了β-紫羅蘭酮的加入影響了生色團的疏水環境。

參考文獻

[1]吳鳳.β-乳球蛋白的分離提純及酶源降膽固醇活性肽的研究[D].安徽農業大學，2009.

[2]李蘭會，孫豐梅，黃娟，等. β-乳球蛋白的熱變性聚集概述[J].中國乳品工業，2002，30（6）：22-24.

[3] Ma B L， You X ， Lu F J. Inhibitory effects of β-ionone on amyloid fibril formation of β-lactoglobulin， Int. J. Biol. Macromol. 2014，64：162-167.

[4] 孫向榮，劉家仁，孫文廣等.β-紫羅蘭酮誘導SGC-7901細胞凋亡作用[J].衛生研究，2007，36（6）：667-670.

[5] 孫青，舒學軍，陳茹冰等.香料紫羅蘭酮的合成研究[J].浙江大學學報（自然科學版），2012，39（1）：56-59.

[6] 劉家仁，李百祥，馬若波等.β-紫羅蘭酮對人乳腺癌細胞抑制作用[J].衛生研究，2004，33（2）：151-157.